Colheita Murino macrófagos alveolares e Avaliação de ativação celular induzida por nanopartículas polianidrido
Summary
Descrevemos os protocolos para a colheita murinos macrófagos alveolares, que são residentes as células imunes inatas no pulmão, e examinando a sua ativação em resposta a co-cultura com nanopartículas polianidrido.
Abstract
Nanopartículas biodegradáveis surgiram como uma plataforma versátil para a concepção e implementação de novas vacinas intranasais contra doenças respiratórias infecciosas. Especificamente, polianidrido nanopartículas composto do ácido alifático sebácico (SA), a aromático 1,6-bis (p-carboxifenoxi)-hexano (CPH), ou o anfifílico 1,8-bis (p-carboxifenoxi) -3,6-dioxaoctane (CPTEG) exibem grandes quantidades única e cinética de erosão de superfície 1,2 e pode ser explorado para libertar lentamente biomoléculas funcionais (por exemplo, os antigénios de proteínas, imunoglobulinas, etc) in vivo 3,4,5. Estas nanopartículas também possuem atividade adjuvante intrínseco, tornando-os uma excelente escolha para uma plataforma de entrega de vacina 6,7,8.
A fim de elucidar os mecanismos que regulam a ativação da imunidade inata após a vacinação da mucosa nasal, deve-se avaliar as respostas moleculares e celulares da p antígenocélulas ressentindo (APCs) responsáveis pelo início respostas imunes. As células dendríticas são as principais APCs encontradas na condução das vias aéreas, enquanto os macrófagos alveolares (AMɸ) predominam no parênquima pulmonar 9,10,11. AMɸ são altamente eficientes na limpeza dos pulmões de micróbios patogénicos e restos celulares 12,13. Além disso, este tipo de célula desempenha um papel importante no transporte de antigénios microbianos para os nódulos linfáticos de drenagem, que é um primeiro passo importante na iniciação de uma resposta imunitária adaptativa 9. AMɸ também expressam níveis elevados de reconhecimento de padrões inata e receptores de catadores, pró-inflamatórias secretam mediadores, e principais células T naive 12,14. Uma população relativamente pura de AMɸ (por exemplo, superior a 80%) pode ser facilmente obtida por meio de lavagens pulmonares para o estudo em laboratório. Residente AMɸ colhidas a partir de animais imunes competentes proporcionar um fenótipo representante dos macrófagos que irá encounter vacina da partícula baseada em in vivo. Descrevemos os protocolos utilizados para colheita e cultura AMɸ de camundongos e examinar o fenótipo de ativação dos macrófagos após o tratamento com nanopartículas polianidrido in vitro.
Protocol
Discussion
Plataformas polianidrido vacina nanopartículas demonstraram eficácia quando administrada por via intranasal em regimes de dose única 5. Medindo a activação das populações de células fagocíticas residentes nos pulmões induzidos por esta plataforma de entrega de vacina permite a avaliação da sua capacidade potencial para, em última análise promover respostas imunes adaptativas.
Especificamente, a colheita macrófagos alveolares no lavado pulmonar e tratá-los com difer…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Os autores gostariam de agradecer os EUA Army Medical Research e Material Command (Números Grant W81XWH-09-1-0386 e W81XWH-10-1-0806) para apoio financeiro e Shawn Dr. Rigby pela Universidade do Estado Iowa Facilidade de Citometria de Fluxo para sua assistência técnica especializada.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalog number | Comments |
| cAM Media | |||
| DMEM | Cellgro | 15-013-CV | |
| 50 mM 2-mercaptoethanol | Sigma | M3148-25ML | |
| Penicillin/Streptomycin 10,000 μg/ mL Solution | Cellgro | 30-002-CI | |
| Fetal Bovine Serum | Atlanta Biologicals | S11150 | |
| FACS Buffer | |||
| Sodium chloride | Fisher Scientific | S671-500 | |
| Sodium phosphate | Fisher Scientific | MK7868500 | |
| Potassium chloride | Fisher Scientific | P217500 | |
| Potassium phosphate | Fisher Scientific | P288-200 | |
| BSA (Bovine Serum Albumin) | Sigma | A7888 | |
| Sodium Azide | Sigma | S2002 | |
| Antibodies | |||
| Rat IgG | Sigma | I4341 | |
| Anti-Ms CD16/32 | eBioscience | 16-0161 | |
| Anti-Ms MHC II haplotype I-A/I-E, clone M5/114.15.2, conjugated to fluorescein isothiocyanate (FITC) | eBioscience | 11-5321 | |
| Anti-mouse CD86, clone GL-1, conjugated to allophycocyanin (APC)-Cy7 | Biolegend | 105030 | |
| Anti-mouse CD40, clone 1C10, conjugated to APC | eBioscience | 17-0401 | |
| Anti-mouse CD209, clone 5H10, conjugated to Biotin | eBioscience | 13-2091 | |
| Anti-mouse CD11b, clone M1/70, conjugated to Alexa Fluor 700 | eBioscience | 56-0112 | |
| Anti-mouse F4/80, clone BM8, conjugated to phycoerythrin (PE)-Cy7 | eBioscience | 25-4801 | |
| PE-Texas red conjugated Streptavidin | BD Biosciences | 551487 | |
| Other Supplies and Reagents | |||
| Ethanol | Fisher Scientific | A405-20 | Used as 70% (v/v) |
| Compressed CO2 | Linweld | 16000060 | |
| 1 mL Syringe | BD Biosciences | 309659 | |
| Sovereign 3 ½” Fr Tom Catcatheter | Kendall | 703021 | |
| Biosafety Cabinet | NUAIRE | Series 22 | |
| Dissection Scissors | Fisher | 138082 | |
| Forceps | Roboz | RS-8254 | |
| PBS, 1X without calcium and magnesium | Cellgro | 21-040-CM | |
| 15 mL Centrifuge Tubes with Screw Cap | VWR International | 21008-216 | |
| Six-well Tissue Culture Treated Plates | Costar | 3516 | |
| Plastic Tube Racks | Nalgene | 5970 | |
| Cell Scraper 24 cm | TPP | 99002 | |
| 5 mL Polystyrene Round-Bottom Tube | Falcon | 352008 | |
| Pipet-aid XL | Drummond | 4-000-105 | |
| 10, 5, and 2 mL Pipettes | Fisher | 13-675 | |
| 200 and 10 μL micropipettors | Gilson Pipetman | F123601 | |
| 200 and 10 μL pipette tips | Fisher | 02-707 | |
| BD Stabilizing Fixative | BD Biosciences | 338036 | |
| Isoton II Diluent | Beckman-Coulter | 8546719 | |
| Zap-oglobin II Lytic Reagent | Beckman-Coulter | 7546138 | |
| Coulter Counter Polystyrene Vials | Beckman-Coulter | 14310-684 | |
| Test Tubes | BD Biosciences | 352008 | |
| Equipment | |||
| Refrigerated Centrifuge | Labnet | 50075040 | |
| Humidified Incubator CO2 | Nuaire | Model Autoflow 8500 | |
| FACSCanto Flow Cytometer | BD Biosciences | 338960 | |
| Coulter Particle Counter Z1 | Beckman-Coulter | WS-Z1DUALPC | |
| Sonicator Liquid Processing Equipment with Microtip | Misonix | Model No. S-4000 |
References
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