Isolasjon og Genome Analysis of single Virioner bruker 'enkelt virus Genomics'
Summary
Enkelt virus Genomics (SVG) er en metode for å isolere og forsterke genomet av single virons. Virale suspensjoner av en blandet samling sorteres ved hjelp av flow cytometri på et objektglass med diskrete brønner inneholdende agarose, for derved å fange virion og redusere genomet klipping under nedstrøms bearbeiding. Hele genomet forsterkning oppnås ved bruk av multippel forskyvning forsterkning (MDA) som resulterer i genomisk materiale som er egnet for sekvensering.
Abstract
Hele genomet forsterkning og sekvensering av single mikrobielle celler gjør genomisk karakterisering uten behov for dyrking 1-3. Virus, som er allestedsnærværende og de mest tallrike enheter på planeten vår 4 og viktig i alle miljøer 5, har ennå ikke avslørt via lignende tilnærminger. Her beskriver vi en tilnærming for å isolere og karakterisere de genomer av single virions kalt "enkelt virus Genomics '(SVG). SVG benytter strømningscytometri for å isolere individuelle virus og hele genomet forsterkning for å oppnå høy molekylvekt genomisk DNA (gDNA) som kan anvendes i de følgende reaksjoner sekvensering.
Protocol
Discussion
En rekke viktige faktorer som må tas i betraktning når du søker SVG tilnærminger. Genotyping, som ble utført i løpet av proof-of-concept eksperiment 13, er ikke et gyldig alternativ for miljø eller ukjente isolater som bevarte primere er ikke tilgjengelig på tvers av alle virus-grupper. Dessuten er bakgrunnen DNA syntese eller uspesifikke forsterkning ofte rapportert under forsterkning ved hjelp av MDA reaksjon 14. Ikke-spesifikk amplifikasjon har blitt tilskrevet kontaminerende DNA dukker …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi vil gjerne takke Ken Nealson for hans innsikt og rådgivning gjennom hele manuskriptet forberedelsesprosessen.
Materials
| Material Name | Company | Catalogue Number | Comments |
| 1X TE buffer | Invitrogen | 12090-015 | |
| Buffer-saturated Phenol | Invitrogen | 15513-039 | |
| GenomiPhi HY kit | GE Healthcare | 25-6600-22 | |
| Glycoblue | Invitrogen | AM9516 | 15 mg/ml |
| LMP agarose | Invitrogen | 16520100 | |
| PTFE microscope slide | Electron Microscopy Sciences | 63430-04 | 24 well, 4 mm Diameter |
| SybrGreen | Invitrogen | S7585 | 10,000X |
| β-agarase | New England Biolabs | M0392S |
References
- Raghunathan, A., et al. Genomic DNA amplification from a single bacterium. Appl. Environ. Microbiol. 71, 3342-337 (2005).
- Lasken, R. S. Single-cell genomic sequencing using Multiple Displacement Amplification. Curr. Opin. Microbiol. 10, 510-516 (2007).
- Ishoey, T., Woyke, T., Stepanauskas, R., Novotny, M., Lasken, R. S. Genomic sequencing of single microbial cells from environmental samples. Curr. Opin. Microbiol. 11, 198-204 (2008).
- Edwards, R. A., Rohwer, F. Viral metagenomics. Nature Reviews Microbiology. 3, 504-510 (2005).
- Rohwer, F., Prangishvili, D., Lindell, D. Roles of viruses in the environment. Environ. Microbiol. 11, 2771-2774 (2009).
- Williamson, S. J., et al. The Sorcerer II Global Ocean Sampling Expedition: metagenomic characterization of viruses within aquatic microbial samples. PLoS ONE. 3, e1456 (2008).
- John, S. G., et al. A simple and efficient method for concentration of ocean viruses by chemical flocculation. Environ. Microbiol. Rep. 3, 195-202 (2011).
- Noble, R., Fuhrman, J. Use of SYBR Green I for rapid epifluorescence counts of marine viruses and bacteria. Aquat Microb Ecol. 14, 113-118 (1998).
- Hara, S., Terauchi, K., Koike, I. Abundance of viruses in marine waters: assessment by epifluorescence and transmission electron microscopy. Appl. Environ. Microbiol. 57, 2731-2734 (1991).
- Hennes, K. P., Suttle, C. A. Direct counts of viruses in natural waters and laboratory cultures by epifluorescence microscopy. Limnol. Oceanogr. 40, 1050-1055 (1995).
- Marie, D., Brussaard, C. P. D., Thyrhaug, R., Bratbak, G., Vaulot, D. Enumeration of marine viruses in culture and natural samples by flow cytometry. Appl. Environ. Microbiol. 65, (1999).
- Brussaard, C. P. Enumeration of bacteriophages using flow cytometry. Methods Mol. Biol. 501, 97-111 (2009).
- Allen, L. Z., et al. Single Virus Genomics: A New Tool for Virus Discovery. Plos One. 6, (2011).
- Hutchison, C. A., Smith, H. O., Pfannkoch, C., Venter, J. C. Cell-free cloning using phi 29 DNA polymerase. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102, 17332-17336 (2005).
