Multimodal Imaging af stamcelle implantation i det centrale nervesystem mus
Summary
Denne artikel beskriver en optimeret sekvens af begivenheder for multimodal billeddannelse af cellulære transplantater i gnaverhjerne med: (i) in vivo bioluminescens og magnetisk resonansimagografi, og (ii) post mortem histologisk analyse. Ved at kombinere disse billeddiagnostiske metoder på et enkelt dyr giver cellulære graft evaluering med høj opløsning, følsomhed og specificitet.
Abstract
I det sidste årti har stamcelletransplantation vundet stigende interesse som primær eller sekundær terapeutisk modalitet for en række sygdomme, både i prækliniske og kliniske undersøgelser. Men til dato resultater med hensyn til det funktionelle resultat og / eller vævsregeneration følgende stamcelletransplantation er ret forskellige. Generelt er en klinisk fordel observeres uden dybere forståelse af de underliggende mekanisme (r) 1. Derfor har flere indsats førte til udviklingen af forskellige molekylære billeddiagnostiske metoder til at overvåge stamceller podning med det endelige mål at præcist vurdere overlevelse, skæbne og fysiologi af podede stamceller og / eller deres mikro-miljø. Observerede ændringer i en eller flere parametre bestemmes ved molekylær billeddannelse kan være relateret til den observerede kliniske effekt. I denne sammenhæng fokusere vores undersøgelser på kombineret anvendelse af bioluminescens imaging (BLI), magnetisk resonans imaging (MRI) og histologiske analysis vurdere stamcelle podning.
BLI er almindeligt anvendt til ikke-invasivt at udføre cellesporing og overvåge celleoverlevelse i tid efter transplantation 2-7, baseret på en biokemisk reaktion, hvor celler, der udtrykker luciferase-reportergenet, er i stand til at udsende lys efter interaktion med dets substrat (fx D- luciferin) 8, 9. MRI på den anden side er en ikke-invasiv teknik, som er klinisk relevant 10 og kan anvendes til præcist at lokalisere cellulære transplantater med meget høj opløsning 11-15, selv om dens følsomhed afhænger i høj grad kontrast genereret efter cellemærkning med et MRI-kontrastmiddel . Endelig post mortem histologisk analyse er den foretrukne fremgangsmåde til validering forskningsresultater opnået med ikke-invasive teknikker med den højeste opløsning og følsomhed. Endvidere endepunkt histologisk analyse gør det muligt at udføre detaljeret fænotypisk analyse af podede celler og / eller det omgivende væv, baSED om brugen af fluorescerende reporter-proteiner og / eller direkte cellemærkning med specifikke antistoffer.
Sammenfattende, her er vi visuelt påvise komplementariteten af BLI, MRI og histologi at udrede forskellige stamcelle-og / eller miljø-associerede egenskaber som følge stamceller podning i centralnervesystemet hos mus. Som et eksempel marv-afledte knogle stromaceller, genetisk manipuleret til at udtrykke forøget Green Fluorescent Protein (EGFP) og ildflueluciferase (udsving), og mærkes med fluorescerende blå mikrometerstore jernoxidpartikler (MPIOs) vil blive podet på CNS af immun-kompetente mus, og resultaterne vil blive overvåget af BLI, MRI og histologi (figur 1).
Protocol
Discussion
I denne rapport beskriver vi en optimeret protokol til en kombination af tre komplementære billeddiagnostiske metoder (BLI, MRI og histologi) for detaljeret karakterisering af cellulære implantater i CNS i immunkompetente mus. En kombination af reportergen mærkning af celler, baseret på genetisk modifikation med reportergener ildflueluciferase og EGFP og en direkte cellemærkning med GB MPIO, fører til en nøjagtig vurdering af stamceller transplantater in vivo.
For partikel m?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
| IMDM | Lonza | BE12-722F | Component of the cell growth medium CEM |
| Fetal bovine serum | Gibco | 10270-106 | Component of the cell growth medium CEM |
| Horse serum | Gibco | 1605-122 | Component of the cell growth medium CEM |
| Penicillin-streptomycin | Gibco | 15140 | Component of the cell growth medium CEM |
| Fungizone | Gibco | 15290-018 | Component of the cell growth medium CEM |
| PBS | Gibco | 14190 | |
| Puromycine | Invivogen | ant-pr-1 | |
| trypsin | Gibco | 25300 | |
| GB MPIO | Bangs Laboratories | ME04F/7833 | |
| D-luciferin | Promega | E1601 | |
| Ketamine (Ketalar) | Pfizer | ||
| Xylazine (Rompun) | Bayer Health care | ||
| Isoflurane | Isoflo | 05260-05 | |
| 0.9% NaCl solution | Baxter | ||
| paraformaldehyde | Merck | 1.04005.1000 | |
| sucrose | Applichem | A1125 | |
| Micro-injection pump | KD scientific | KDS100 | |
| Photon imager | Biospace Lab | ||
| 9.4T MR scanner | Bruker Biospin | Biospec 94/20 USR | |
| BX51 microscope | Olympus | BX51 | |
| Mycrom HM cryostat | Prosan | HM525 | |
| syringe | Hamilton | 7635-01 | |
| 30 gauge needle | Hamilton | 7762-03 | |
| Photo Vision software | Biospace Lab | ||
| M3vision software | Biospace Lab | ||
| Paravision 5.1 software | Bruker Biospin | ||
| Amira 4.0 software | Visage Imaging |
References
- Rodriguez-Porcel, M., Wu, J. C., Gambhir, S. S. . Molecular imaging of stem cells. , (2008).
- Bergwerf, I., De Vocht, N., Tambuyzer, B. Reporter gene-expressing bone marrow-derived stromal cells are immune-tolerated following implantation in the central nervous system of syngeneic immunocompetent mice. BMC Biotechnol. 9, 1 (2009).
- Bergwerf, I., Tambuyzer, B., De Vocht, N. Recognition of cellular implants by the brain’s innate immune system. Immunol. Cell Biol. 89, 511-516 (2011).
- Bradbury, M. S., Panagiotakos, G., Chan, B. K. Optical bioluminescence imaging of human ES cell progeny in the rodent CNS. J. Neurochem. 102, 2029-2039 (2007).
- De Vocht, N., Bergwerf, I., Vanhoutte, G. Labeling of Luciferase/eGFP-Expressing Bone Marrow-Derived Stromal Cells with Fluorescent Micron-Sized Iron Oxide Particles Improves Quantitative and Qualitative Multimodal Imaging of Cellular Grafts In Vivo. Mol Imaging Biol. , (2011).
- Reekmans, K., Praet, J., Daans, J. Current Challenges for the Advancement of Neural Stem Cell Biology and Transplantation Research. Stem Cell Rev. , (2011).
- Reekmans, K. P., Praet, J., De Vocht, N. Clinical potential of intravenous neural stem cell delivery for treatment of neuroinflammatory disease in mice. Cell Transplant. 20, 851-869 (2011).
- Contag, C. H., Bachmann, M. H. Advances in in vivo bioluminescence imaging of gene expression. Annu. Rev. Biomed. Eng. 4, 235-260 (2002).
- Sadikot, R. T., Blackwell, T. S. Bioluminescence imaging. Proc. Am. Thorac. Soc. 2, 511-540 (2005).
- Sykova, E., Jendelova, P., Herynek, V. MR tracking of stem cells in living recipients. Methods Mol. Biol. 549, 197-215 (2009).
- Daadi, M. M., Li, Z., Arac, A. Molecular and magnetic resonance imaging of human embryonic stem cell-derived neural stem cell grafts in ischemic rat. 17, 1282-1291 (2009).
- Heyn, C., Ronald, J. A., Ramadan, S. S. In vivo MRI of cancer cell fate at the single-cell level in a mouse model of breast cancer metastasis to the brain. Magn. Reson. Med. 56, 1001-1010 (2006).
- Hoehn, M., Kustermann, E., Blunk, J. Monitoring of implanted stem cell migration in vivo: a highly resolved in vivo magnetic resonance imaging investigation of experimental stroke in rat. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99, 16267-16272 (2002).
- Jendelova, P., Herynek, V., DeCroos, J. Imaging the fate of implanted bone marrow stromal cells labeled with superparamagnetic nanoparticles. Magn. Reson. Med. 50, 767-776 (2003).
- Modo, M., Mellodew, K., Cash, D. Mapping transplanted stem cell migration after a stroke: a serial, in vivo magnetic resonance imaging study. Neuroimage. 21, 311-317 (2004).
- Boutry, S., Brunin, S., Mahieu, I. Magnetic labeling of non-phagocytic adherent cells with iron oxide nanoparticles: a comprehensive study. Contrast Media Mol. Imaging. 3, 223-232 (2008).
- Mailander, V., Lorenz, M. R., Holzapfel, V. Carboxylated superparamagnetic iron oxide particles label cells intracellularly without transfection agents. Mol Imaging Biol. 10, 138-146 (2008).
- Modo, M., Hoehn, M., Bulte, J. W. Cellular MR imaging. Mol. Imaging. 4, 143-164 (2005).
- Hinds, K. A., Hill, J. M., Shapiro, E. M. Highly efficient endosomal labeling of progenitor and stem cells with large magnetic particles allows magnetic resonance imaging of single cells. Blood. 102, 867-872 (2003).
- Shapiro, E. M., Sharer, K., Skrtic, S. In vivo detection of single cells by MRI. Magn. Reson. Med. 55, 242-249 (2006).
- Shapiro, E. M., Skrtic, S., Sharer, K. MRI detection of single particles for cellular imaging. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101, 10901-10906 (2004).
- Crabbe, A., Vandeputte, C., Dresselaers, T. Effects of MRI contrast agents on the stem cell phenotype. Cell Transplant. 19, 919-936 (2010).
- Szarecka, A., Xu, Y., Tang, P. Dynamics of firefly luciferase inhibition by general anesthetics: Gaussian and anisotropic network analyses. Biophys. J. 93, 1895-1905 (2007).
- Keyaerts, M., Heneweer, C., Gainkam, L. O. Plasma protein binding of luciferase substrates influences sensitivity and accuracy of bioluminescence imaging. Mol. Imaging. Biol. 13, 59-66 (2011).
- Keyaerts, M., Verschueren, J., Bos, T. J. Dynamic bioluminescence imaging for quantitative tumour burden assessment using IV or IP administration of D: -luciferin: effect on intensity, time kinetics and repeatability of photon emission. Eur. J. Nucl. Med. Mol. Imaging. 35, 999-1007 (2008).
- Zhang, Y., Bressler, J. P., Neal, J. ABCG2/BCRP expression modulates D-Luciferin based bioluminescence imaging. Cancer Res. 67, 9389-9397 (2007).
- Brightwell, G., Poirier, V., Cole, E. Serum-dependent and cell cycle-dependent expression from a cytomegalovirus-based mammalian expression vector. Gene. 194, 115-123 (1997).
- Grassi, G., Maccaroni, P., Meyer, R. Inhibitors of DNA methylation and histone deacetylation activate cytomegalovirus promoter-controlled reporter gene expression in human glioblastoma cell line U87. Carcinogenesis. 24, 1625-1635 (2003).
- Krishnan, M., Park, J. M., Cao, F. Effects of epigenetic modulation on reporter gene expression: implications for stem cell imaging. FASEB J. 20, 106-108 (2006).
- Svensson, R. U., Barnes, J. M., Rokhlin, O. W. Chemotherapeutic agents up-regulate the cytomegalovirus promoter: implications for bioluminescence imaging of tumor response to therapy. Cancer Res. 67, 10445-10454 (2007).
