Imaging multimodale impianto di cellule staminali nel sistema nervoso centrale di topi
Summary
Questo articolo descrive una sequenza ottimizzata di eventi per l'imaging multimodale di innesti cellulari nel cervello di roditori utilizzando: (i) in bioluminescenza vivo e la risonanza magnetica, e (ii) post mortem l'analisi istologica. La combinazione di queste modalità di imaging su un singolo animale consente la valutazione del trapianto cellulare ad alta risoluzione, sensibilità e specificità.
Abstract
Nel corso dell'ultimo decennio, il trapianto di cellule staminali ha acquisito un crescente interesse come primario o secondario modalità terapeutica per una varietà di malattie, sia negli studi preclinici e clinici. Tuttavia, ad oggi i risultati per quanto riguarda i risultati funzionali e / o la rigenerazione dei tessuti a seguito di trapianto di cellule staminali sono molto diverse. In generale, un beneficio clinico si osserva senza profonda comprensione del meccanismo sottostante (s) 1. Pertanto, gli sforzi multipli hanno portato allo sviluppo di diverse modalità di imaging molecolare per monitorare cellule staminali innesto con l'obiettivo finale di valutare con precisione la sopravvivenza, destino e fisiologia delle cellule staminali innestate e / o loro micro-ambiente. I cambiamenti osservati in uno o più parametri determinati dalla imaging molecolare potrebbe essere correlato all'effetto clinico osservato. In questo contesto, i nostri studi si concentrano sull'uso combinato di imaging bioluminescenza (BLI), risonanza magnetica (MRI) e l'analisi dell istologicas per valutare cellule staminali innesto.
BLI viene comunemente utilizzato per non invasivo eseguire il monitoraggio delle cellule e la sopravvivenza cellulare monitorare in tempo successivo trapianto 2-7, basato su una reazione biochimica in cui le cellule che esprimono il gene reporter luciferasi sono in grado di emettere luce seguente interazione con il suo substrato (per esempio D- luciferina) 8, 9. MRI invece è una tecnica non invasiva che è clinicamente applicabile 10 e può essere utilizzata per localizzare con precisione innesti cellulari ad altissima risoluzione 11-15, sebbene la sua sensibilità dipende fortemente dal contrasto generato dopo marcatura delle cellule con un agente di contrasto MRI . Infine, post-mortem analisi istologica è il metodo di scelta per convalidare i risultati della ricerca ottenuti con tecniche non invasive con la più alta risoluzione e sensibilità. Inoltre end-point analisi istologica ci permette di eseguire una dettagliata analisi fenotipica delle cellule innestate e / o il tessuto circostante, based sull'uso di proteine reporter fluorescenti e / o etichettatura diretto di cellule con anticorpi specifici.
In sintesi, siamo qui visivamente dimostrare la complementarietà di BLI, MRI e istologia di svelare cellule staminali e diversi / o l'ambiente associate le seguenti caratteristiche innesto di cellule staminali nel sistema nervoso centrale di topi. Come esempio, midollo osseo, le cellule stromali geneticamente ingegnerizzati per esprimere la proteina fluorescente verde maggiore (EGFP) e luciferasi di lucciola (Fluc), e marcato con blu di ferro particelle fluorescenti dimensioni micron di ossido (MPIOs), verrà innestata nella SNC di topi immuno-competenti ei risultati saranno monitorati da BLI, MRI e istologia (Figura 1).
Protocol
Discussion
In questo rapporto, descriviamo un protocollo ottimizzato per la combinazione di tre modalità di imaging complementari (BLI, MRI e istologia) per la caratterizzazione dettagliata degli impianti cellulari nel SNC di topi immuni competenti. Una combinazione di etichettatura gene reporter di cellule, basata sulla modificazione genetica con i geni reporter lucciola, luciferasi e eGFP, e una cella di etichettatura diretta con GB MPIO, porta ad una valutazione accurata degli innesti di cellule staminali in vivo. </p…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
| IMDM | Lonza | BE12-722F | Component of the cell growth medium CEM |
| Fetal bovine serum | Gibco | 10270-106 | Component of the cell growth medium CEM |
| Horse serum | Gibco | 1605-122 | Component of the cell growth medium CEM |
| Penicillin-streptomycin | Gibco | 15140 | Component of the cell growth medium CEM |
| Fungizone | Gibco | 15290-018 | Component of the cell growth medium CEM |
| PBS | Gibco | 14190 | |
| Puromycine | Invivogen | ant-pr-1 | |
| trypsin | Gibco | 25300 | |
| GB MPIO | Bangs Laboratories | ME04F/7833 | |
| D-luciferin | Promega | E1601 | |
| Ketamine (Ketalar) | Pfizer | ||
| Xylazine (Rompun) | Bayer Health care | ||
| Isoflurane | Isoflo | 05260-05 | |
| 0.9% NaCl solution | Baxter | ||
| paraformaldehyde | Merck | 1.04005.1000 | |
| sucrose | Applichem | A1125 | |
| Micro-injection pump | KD scientific | KDS100 | |
| Photon imager | Biospace Lab | ||
| 9.4T MR scanner | Bruker Biospin | Biospec 94/20 USR | |
| BX51 microscope | Olympus | BX51 | |
| Mycrom HM cryostat | Prosan | HM525 | |
| syringe | Hamilton | 7635-01 | |
| 30 gauge needle | Hamilton | 7762-03 | |
| Photo Vision software | Biospace Lab | ||
| M3vision software | Biospace Lab | ||
| Paravision 5.1 software | Bruker Biospin | ||
| Amira 4.0 software | Visage Imaging |
References
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