Purification et visualisation de lipopolysaccharide de bactéries à Gram négatif par Hot-phénol aqueux d'extraction
Summary
Nous décrivons une méthode modifiée de chaud extraction aqueuse de phénol pour purifier le lipopolysaccharide (LPS) de bactéries Gram-négatives. Une fois extraite, les LPS peuvent ensuite être analysées par SDS-PAGE et visualisés par coloration directe ou immunoblot de l'Ouest.
Abstract
Lipopolysaccharide (LPS) est une composante majeure de bactéries Gram-négatives membranes externes bactériennes. Il est une molécule tripartite composé de lipide A, qui est incorporé dans la membrane externe, un noyau oligosaccharides et répéter O-antigène unités qui s'étendent vers l'extérieur depuis la surface de la cellule 1, 2. LPS est une molécule immunodominant qui est important pour la virulence et la pathogenèse de nombreuses espèces bactériennes, y compris Pseudomonas aeruginosa, Salmonella et Escherichia coli 3-5, et les différences dans la forme LPS composition de l'antigène O la base pour le sérotypage des souches. LPS est impliqué dans l'attachement à des cellules hôtes lors de l'initiation de l'infection et offre une protection contre médiée par le complément meurtre; souches qui n'ont pas LPS peuvent être atténuées pour la virulence 6-8. Pour ces raisons, il est important de visualiser LPS, en particulier à partir d'isolats cliniques. LPS Visualisation profils de bandes et de la reconnaissance spécifique d'un parntibodies peuvent être des outils utiles pour identifier les lignées de contrainte et de caractériser différents mutants.
Dans ce rapport, nous décrivons une chaude aqueuse-phénol méthode pour l'isolement et la purification de LPS de bactéries Gram-négatives des cellules bactériennes. Ce protocole permet l'extraction de LPS l'écart des acides nucléiques et des protéines qui peuvent interférer avec la visualisation de LPS qui se produit avec plus courts, des méthodes d'extraction moins intensives 9. LPS préparés de cette façon peuvent être séparés par le dodécylsulfate de sodium (SDS)-électrophorèse sur gel de polyacrylamide (PAGE) et directement teinté à l'aide de glucides / glycoprotéine taches ou les méthodes standard de coloration à l'argent. Beaucoup anti-sérums contiennent des anticorps au LPS que des réactions croisées avec les protéines de membrane externe ou des cibles antigéniques d'autres qui peuvent nuire à la réactivité observés à la suite de l'Ouest de la immunoblot SDS-PAGE-séparés lysats cellulaires bruts. Le traitement aux protéases de lysats cellulaires bruts seuls n'est pas toujours un moyen efficace d'éliminer cettede fond en utilisant tel ou autres méthodes de visualisation. En outre, le traitement protéase vaste dans une tentative de supprimer ce fond peut conduire à LPS de mauvaise qualité qui n'est pas bien résolus par l'une des méthodes ci-dessus. Pour ces raisons, nous croyons que le protocole suivant, adapté de Westpahl et Jann 10, est idéal pour l'extraction de LPS.
Protocol
Discussion
Nous avons décrit un procédé de purification LPS l'écart des autres composants cellulaires, y compris les acides nucléiques et des protéines. Cette méthode offre une haute qualité LPS qui peuvent être utilisés dans un certain nombre de méthodes de visualisation différentes, y compris la coloration des glucides gels SDS-PAGE, comme le montre la figure 1. Cette méthode peut être utilisée au sérotype LPS à partir d'une variété de souches, à l'aide spécifique anti-sérums, ou pour montrer la…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce travail a été soutenu par des subventions du National Institutes of Health et la Fondation de la fibrose kystique.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number |
| DNase I recombinant, RNase-free | Roche | 04716728001 |
| RNase A | Roche | 10109169001 |
| Proteinase K | Fisher | BP1700 |
| Tris-Saturated Phenol | Fisher | BP1750-100 |
| Diethyl Ether | Thomas Scientific | C313K31 |
| Pro-Q Emerald 300 Lipopolysaccharide Gel Stain Kit | Molecular Probes | P20495 |
References
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