العزلة والثقافة من خلايا الفئران العصبية الجنينية: بروتوكول سريعة
Summary
وصفنا منهجية السريع لعزل والثقافة الخلايا العصبية قرن آمون والقشرة من أجنة القوارض. هذا البروتوكول يسمح لنا لإجراء تجارب التي يلزم فيها الثقافات العصبية نقي تقريبا.
Abstract
نحن تصف طريقة سريعة لفصل الخلايا العصبية قرن آمون والثقافة أو من أجنة الفئران القشرية E15-17. ويمكن تطبيق هذا الإجراء بنجاح إلى العزلة من الفأر والخلايا العصبية الأولية الإنسان والأسلاف العصبية. تتم المحافظة على الخلايا العصبية في فصل المصل خالية المتوسطة تصل إلى عدة أسابيع. ويمكن استخدام هذه الثقافات لnucleofection، كيمياء سيتولوجية مناعية، الأحماض النووية الإعداد، وكذلك الكهربية. ويمكن أيضا أن أقدم الثقافات العصبية يمكن transfected مع معدل كفاءة جيدة من خلال تنبيغ lentiviral، وأقل كفاءة، مع فوسفات الكالسيوم أو للدهون، على أساس أساليب مثل lipofectamine.
Protocol
Discussion
ووصف طريقة تشريح وثقافة من الخلايا العصبية الفئران قرن آمون والقشرة هنا يتيح إجراء التجارب باستخدام الخلايا العصبية الثقافات نقي تقريبا نمت في المتوسط محددة الصفات كيميائيا (الشكل 3). وعلى الرغم من بروتوكولات لزراعة الخلايا العصبية في مصل الدم النقي تقر…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
نشكر يونا اليس للحصول على مساعدة التحرير. وأيد المشروع التي وصفها عدد جائزة R01MH079751 (PI: F. بيروتزي) من المعهد الوطني للصحة العقلية. المحتوى هو فقط من مسؤولية الكتاب ولا تمثل بالضرورة وجهة النظر الرسمية للمعهد الوطني للصحة العقلية أو المعاهد الوطنية للصحة.
Materials
| Reagent | Concentration |
| Neurobasal | 98% |
| B27 | 2% |
| Glutamax | 0.5 mM |
Table I. Neurobasal/B27 complete medium.
| Reagent | Concentration |
| Glucose | 16 mM |
| Sucrose | 22 mM |
| HEPES | 10 mM |
| NaCl | 160 mM |
| KCl | 5 mM |
| Na2HPO4 | 1 mM |
| KH2PO2 | 0.22 mM |
| Gentamicin | 50 μg/ml |
| Fungizone | 250 ng/ml |
| pH | 7.4 |
| Osmolarity | 320-330 mOsm |
Table II. Dissection medium.
| Reagent | Volume (μl) |
| Neurobasal/B27 complete medium | 240 |
| Trypan Blue Stain 0.4% | 250 |
| Total | 490 |
Table III. 50x Counting solution.
| Reagent | Company | Cat. number |
| Hibernate E | Brainbits | 767171 |
| Neurobasal | Gibco, Invitrogen | 21103-049 |
| B27 | Gibco, Invitrogen | 17504-044 |
| Fungizone | Gibco, Invitrogen | 15290-018 |
| Gentamicin sulfate | Sigma Aldrich | G1264 |
| Glutamax 200 mM | Gibco, Invitrogen | 35050 |
| TrypLE Express w/o phenol red | Gibco, Invitrogen | 12604 |
| Cytosine-β-D-arabinofuranoside hydrochloride | Sigma Aldrich | C6645 |
| Poly-D-Lysine | Sigma Aldrich | P6407 |
| Laminin 1 mg/ml | Millipore | CC095 |
| HEPES | Sigma Aldrich | H3375 |
| Trypan Blue Stain 0.4% | Gibco, Invitrogen | 15250 |
Table IV. Specific reagents.
| Equipment | Company | Cat. number |
| Stereo Microscope | Olympus | SZ61 |
| Large Forceps | FST | 11022-14 |
| Fine-tipped forceps | Moria | MC40B |
| Micro fine-tipped forceps | Moria | MC31 |
| Razor-sharp scissors | Roboz | RS-6820 |
| Micro Dissecting scissors | FST | 91460-11 |
| Micro Dissecting Curved scissors | FST | 14067-11 |
| Glass 2-chamber slides | Lab-Tek | 154461 |
| 60 mm dishes | BD Falcon | 353002 |
| 100 mm dishes | Corning | 430167 |
| 15 ml tubes | BD Falcon | 352099 |
| 1.5 ml cryo-tube vial | Nunc | 375353 |
Table V. Specific equipment.
References
- Aprea, S. Tubulin-mediated binding of human immunodeficiency virus-1 Tat to the cytoskeleton causes proteasomal-dependent degradation of microtubule-associated protein 2 and neuronal damage. J. Neurosci. 26, 4054-4062 (2006).
- Kivell, B. M., McDonald, F. J., Miller, J. H. Serum-free culture of rat post-natal and fetal brainstem neurons. Brain Res. Dev. Brain Res. 120, 199-210 (2000).
- Kivell, B. M., McDonald, F. J., Miller, J. H. Method for serum-free culture of late fetal and early postnatal rat brainstem neurons. Brain Res. Brain Res. Protoc. 6, 91-99 (2001).
- Brewer, G. J. Serum-free B27/neurobasal medium supports differentiated growth of neurons from the striatum, substantia nigra, septum, cerebral cortex, cerebellum, and dentate gyrus. J. Neurosci. Res. 42, 674-683 (1995).
- Banker, G., Goslin, K. . Culturing nerve cells. , (1998).
- Eletto, D. Inhibition of SNAP25 expression by HIV-1 Tat involves the activity of mir-128a. J. Cell Physiol. 216, 764-770 (2008).
- Gualco, E. IGF-IR-dependent expression of Survivin is required for T-antigen-mediated protection from apoptosis and proliferation of neural progenitors. Cell Death Differ. 17, 439-451 (2010).
- Gage, F. H. Survival and differentiation of adult neuronal progenitor cells transplanted to the adult brain. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 92, 11879-11883 (1995).
- Keyser, D. O., Pellmar, T. C. Synaptic transmission in the hippocampus: critical role for glial cells. Glia. 10, 237-243 (1994).
- Pfrieger, F. W., Barres, B. A. Synaptic efficacy enhanced by glial cells in vitro. Science. 277, 1684-1687 (1997).
