实时数字成像大鼠提睾肌缺血再灌注损伤（IRI）的白细胞 - 内皮细胞相互作用

Summary

数字提睾微循环毛细血管静脉活体荧光显微镜是一种方便的方法获得白细胞 - 内皮细胞相互作用的见解在体内

Abstract

在病理条件下，如脑卒中，心肌梗死，肠缺血，以及移植和心血管手术^。1以前缺血组织的再灌注后的大阵，而必要的预防不可逆转的缺血再灌注损伤（IRI）有牵连组织损伤，诱发过度炎症反应受影响的组织。毗邻的活性氧，活化补体系统的生产和增加血管通透性，激活白细胞再灌注过程中的病理级联在炎症组织损伤的原则演员之一^。2，3白细胞激活是一个多步过程组成轧制，坚定的粘附和轮回之间复杂的相互作用的粘附分子介导的反应，如补体因子，趋化因子，血小板活化因子的趋化因子。 <虽然在毛细血管静脉的白细胞滚动主要选择素^5的相互作用介导，与他们的柜台配体，坚定白细胞粘附血管内皮细胞是通过粘附分子（ICAM）与血管细胞结合的选择控制类p ="的jove_content">粘附分子^{（VCAM），6，7}

在体内的白细胞-内皮细胞相互作用观察的金标准是活体显微镜技术，首次在1968年^8。

虽然各个器官缺血再灌注损伤（缺血再灌注损伤）的各种型号^，9-12只有少数是适合微血管床的白细胞招聘的直接可视化的图像质量高的水平上。

在这里，我们促进提睾微循环的毛细血管后微静脉的活体荧光显微镜的数字作为一种方便的方法大鼠IRI的研究，定性和定量分析白细胞招聘横纹肌组织，并为实现该技术提供了一个详细的手册^13。我们进一步说明常见的陷阱，应该使读者能够真正体会，安全地执行方法，并提供有用的提示。

在由步步协议，我们描述如何获得足够的监测，保持时间较长的动物坚决麻醉呼吸控制麻醉下开始。然后，我们描述优秀的光学分辨率为薄平板提睾准备和提供已在我们的实验室建立在IRI白细胞成像的协议。

Protocol

1。麻醉和监测

1. 适当的国家和机构伦理应该在之前进行动物实验。继批准从伦理委员会麻醉男性只SD大鼠的体重从120 - 180克。提供2 - 3％异氟醚，异氟醚蒸发器和一个有机玻璃箱，通过放置在大鼠内。
2. 尽快达到适当的麻醉水平（缺乏反应脚趾或尾巴捏）大鼠加权和腹侧颈区剃光。
3. 放在一个加热垫在背卧鼠体温保持在37°C和异氟醚适用于2卷用硅胶面具％。

最好使用手术显微镜完成以下准备步骤。

4. 准备气管，颈动脉和颈内静脉，在该地区执行Ø水平2厘米的皮肤切口f的胸骨上切迹和动员横向的唾液腺。
5. 你现在面临的腹侧颈部肌肉。仔细在中线分开，发现气管。暴露1 - 2厘米的气管和下放置一个微型镊子，从而提高了。
6. 现在割开一半通过气管的腹侧面。要小心不要削减，一路过关斩将，如果你这样做，气管切端将陷入胸部，是非常困难的工作。
7. 插入进气管，先前已被连接到动物呼吸机下部气管插管使用Abbocath管（14G）。提示:坚定地固定在磁铁夹以及缝合的气管内管周围必须保持在气管插管。我们一般使用涤纶5/0缝线，然而，类似缝合材料都可以使用。
8. 呼吸可以控制量（频率，35 - 45次/分，潮气量，4.5 - 5毫升FIO ₂ 2％）14肺不张是可以预防的，保持一个积极的呼气末压力5至10毫米的H _....

Discussion

白细胞-内皮细胞相互作用，生产活性氧和激活补体系统是IRI的诱导组织功能障碍的主要特点^。26受影响组织的微循环被视为不可分割的炎症发病网站。除了 ​​如流室检测^27，28的 体外实验，它是强制性的，以提供行之有效的活体成像模型，以进一步评估在体内相关。虽然已在不同的器官系统有牵连IRI的，我们在这里描述的方法系统地研究白细胞与内皮细胞相互作用再灌注损伤的横纹肌组织，最早是由贝兹等^13，因此，特别是在瓣手术（ 图1）有关。 ^29，因为它是假定其他器官组织损伤，缺血后涉及相同的炎症机制，所描述的模型可以用来盖缺血再灌注损伤的病理生理机制，在有关条件，如心肌梗死，脑卒中或肠缺血列印原则的见解。

动物用

这里提出的模型是适用于大多数啮齿动物包括大鼠和小鼠。对于成像的长周期，在这个模型是必要的，我们一般喜欢大鼠气管切开术和音量控制呼吸可以很容易地进行。结合通过动脉canulation心血管.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
设备名称:	公司名称:	目录号:	评论:
forene 100％（V / V）	住持	B506	API的异氟醚
涤纶缝合	serag Weissner	OC108000
portex精细孔聚乙烯管材	史密斯医疗	800/100/100	0.28毫米内径
0.9％的生理盐水溶液	fresinus卡比	808771
变化的一个尖端豪华烧灼套件的	bovie医学	警报1动作延迟时间
abbocath-14Gţ	venisystems	G713- A01	作为镜头筒
伺服呼吸机900C	MAQUET		用作动物ventialtor的
逻辑压力传感器	史密斯医疗	MX1960
sirecust 404显示器	西门子
ABL的700台式分析仪	辐射计		血液气体测量
加热垫	effenberger	8319
铝合金舞台	alfun	AW7022
手术显微镜OPMI 6 SDFC	卡尔·蔡司
显微仪器实验室小号等	科技	767
biemer船只夹	迪纳	64.562
应用镊子	迪纳	64.568	为Biemer血管夹
罗丹明6G	Sigma-Aldrich公司	R4127
凡士林白民建联	温斯洛普	2726853
盖玻片			32×32毫米
			活体设置
zeis Axio上范围A-1中太	卡尔Zeis	490036	萤光显微镜
470 nm的LED	卡尔Zeis	423052	荧光光源
科利柏2系统	卡尔Zeis	423052
W计划的复消色差透镜20X / 1,0迪爱生	卡尔Zeis	421452	浸水目标
AxioCam MRM牧师3火线	卡尔Zeis	426509	高清晰度的数码相机
AXIO视力LE软件	卡尔Zeis	410130	用于离线分析