מערכת ל<em> Vivo לשעבר</em> Culturing של לבלב עוברי

Summary

כאן, אנו מתארים שיטה לבידוד, תרבות ומניפולציה של לבלב העוברי של עכבר. זה מייצג מצוין<em> Vivo לשעבר</em> מערכת ללימוד היבטים שונים של פיתוח לבלב, כולל המורפוגנזה, התמיינות וגדילה. explants ניצן הלבלב יכול להיות מתורבת במשך כמה ימים ולהשתמש במגוון של יישומים שונים, כולל כל הר-immunofluorescence והדמיה חייה.

Abstract

הלבלב שולט בתפקודים חיוניים של הגוף שלנו, כולל ייצור של אנזימי עיכול ופיקוח על רמות סוכר בדם ^1. אמנם בעשור האחרון מחקרים רבים תרמו ליסודות מוצקים להבנת organogenesis לבלב, פערים חשובים להתמיד בידע של היווצרות לבלב המוקדמת ² שלנו. הבנה מלאה של האירועים המוקדמים הללו תספק תובנה לתוך הפיתוח של איבר זה, אלא גם למחלות חשוכות מרפא המתמקדות בלבלב, כמו סוכרת או סרטן הלבלב. לבסוף, את המידע הזה יפיק תכנית לפיתוח טיפולים להחלפת תא בהקשר של סוכרת.

במהלך התפתחות עוברת, הלבלב נובע מאוטופיות צמחה עובריות שונות של האנדודרם המעי הקדמי גב וגחון ביום עוברי (E) 9.5 בעבר עכבר ^3,4. שני האוטופיות צמח evaginate לmesenchyme מקיף כepithelia מוצקניצני הליטר, שעוברים התפשטות, מסתעף ובידול לייצר איבר בגרות מלאה ^2,5,6. העדויות האחרונות הראו כי צמיחה והתבדלות של תאי לבלב שושלות, כולל את β-תאים המייצרים אינסולין-, תלויות ברקמות ארכיטקטורת שיפוץ ראוי, אפיתל ומיצוב תא בתוך אפיתל לבלב הסתעפות ^7,8. עם זאת, איך מסתעף המורפוגנזה מתרחשת ומתואם עם ריבוי ובידול בלבלב הוא ידוע ברובם. זה בחלקו בשל העובדה שהידע נוכחי על תהליכים התפתחותיים אלה הסתמך כמעט אך ורק על ניתוח של דגימות קבועות, תוך אירועים המוךפו"גנטי הם דינמיים מאוד.

כאן, אנו מדווחים שיטה לvivo culturing העכבר העוברי לבלב הניצנים לשעבר במנות תחתית זכוכית, המאפשרות הדמיה ישירה של לבלב הפיתוח (איור 1) ולנתח. כת זומערכת יור פתח באופן אידיאלי למיקרוסקופיה confocal סריקת הליזר, ובהדמיה בפרט, חי תאים. explants לבלב יכול להיות מוכן לא רק מעוברי עכברי סוג פראי, אלא גם מזני עכבר מהונדס גנטי (למשל מהונדס או נוקאאוט), המאפשר לימודים בזמן אמיתי של פנוטיפים מוטציה. יתר על כן, מערכת תרבות vivo לשעבר זה יקר כדי לחקור את ההשפעות של תרכובות כימיות על התפתחות לבלב, ומאפשר לקבל מידע כמוני על שגשוג וצמיחה, התארכות, הסתעפות, tubulogenesis והבחנה. לסיכום, הפיתוח של שיטת vivo לשעבר לבלב explant תרבות בשילוב עם הדמיה ברזולוציה גבוהה מספק פלטפורמה חזקה להתבוננות אירועים המוךפו"גנטי ובידול כפי שהם מתרחשים בתוך עובר העכבר המתפתח.

Protocol

הפרוטוקול המתואר כאן הותאם מהטכניקה המתוארת במקור בפרסיבל ו9 מרווח והמותאם למיקרוסקופיה confocal. 1. ציפוי של מנות תרבות תחתית הזכוכית יש לבצע את הפעולות הבאות בתנאים סטריליים בברדס זרימה ל?…

Discussion

ברגע שגורל לבלב מצוין, ותאי לבלב לעבור התפשטות נרחבת, בידול והמורפוגנזה סופו של דבר ליצירת איבר בוגר ותפקודי ^2,4. נכון לעכשיו, איך ההסתעפות מתרחשת בלבלב ואיך זה קשור לריבוי מולידו ובידול היא במידה רבה לא ידוע. תרבויות explant לבלב מייצגות מערכת אידיאלית להבהיר תהליכ…

Materials

Name of the reagent	Company	Catalogue number	Comments
Antibodies: Carboxypeptidase E-cadherin F-actin Glucagon Insulin β1-integrin Pdx1 Pdx1 Phospho-Histone H3	AbD Serotec Invitrogen Molecular Probes ImmunoStar Millipore Millipore Abcam Hybridoma bank Cell Signalling	1810-0006 13-1900 A-12373 20076 4011-01 MAB1997 ab47267 F109-D12 9706
Basal Medium Eagle (BME)	Sigma	B1522-500ML	Kept in sterile conditions
Cell culture grade water	PAA	S15-012	Kept in sterile conditions
Culture dishes (glass-bottomed), 35-mm	MatTek Corporation	P35G-0-20-C
Donkey Serum	Chemicon	S30-100 ml
Fetal calf serum Gold	PAA	A15-151	Kept in sterile conditions
Fibronectin	Invitrogen	330100-8	Stock sol. 1 mg/ml in cell culture grade water
Gentamicin	Invitrogen	15750-037	Kept in sterile conditions
Glutamine	Invitrogen	25030-024	Kept in sterile conditions
4-well Multidishes	Nunc	176740
Microscopes: Inverted Confocal Microscope (LSM 700) Stereomicroscope (Discovery V12)	Zeiss Zeiss		Objectives: C-Apochromat 10X / 0.45 W M27 (work. dist. 1.8 mm; imaging depth ~100 mm); C-Apochromat 40X / 1.2 W Corr M27 (work. dist. 0.28 mm; ~imaging depth 50 μm) Transillumination from below and fiber-optic illumination from above
Paraformaldehyde	Roth	0335.3	Stock solution 20%
Pasteur Pipet (Glass), 150 mm	VWR	HECH567/1
Penicillin/Streptomycin	PAA	P11-010	Kept in sterile conditions
Petri dishes, 60 mm	Greiner Bio-One	628102
Petri dishes, 35 mm	Greiner Bio-One	627161
1X PBS, pH7.4	PAA	H15-002	Kept in sterile conditions
Spring Scissors 8 mm blade curved	Fine Science Tools	15023-10
Triton-X100	Roth	3051.3
Watchmaker’s foreceps Dumont #5	Roth	K342.1