Için bir sistem<em> Ex vivo</emEmbriyonik Pankreas> ekimi

Summary

Burada, fare embriyonik pankreas izolasyonu, kültür ve manipülasyon için bir yöntem açıklanmaktadır. Bu mükemmel bir temsil<em> Ex vivo</emMorfolojilerinden, farklılaşma ve büyüme gibi pankreas gelişiminin çeşitli yönlerini incelemek için> sistemi. Pankreatik tomurcuk eksplantlar birkaç gün boyunca kültürlendi ve bütün monte immunofloresans ve canlı görüntüleme de dahil olmak üzere farklı uygulama, bir dizi içinde kullanılabilir.

Abstract

Pankreas sindirim enzimleri ve kan şekeri düzeylerini ¹ düzenlenmesi üretimi dahil olmak üzere vücudun hayati fonksiyonları kontrol eder. Geçtiğimiz on yıl içinde birçok çalışma pankreas organogenez anlamak için sağlam bir temel katkıda bulunmuş olsa da, önemli boşluklar erken pankreas oluşumu ² bilgimizi devam etmektedir. Bu erken olayların tam bir anlayış bu organın gelişimini içgörü sağlayabilir, ama aynı zamanda, diyabet veya pankreas kanseri gibi pankreas hedef tedavi edilemez hastalıklar, girer. Son olarak, bu bilgi diyabet kapsamında hücre-değiştirme tedavileri geliştirmek için bir şablon oluşturur.

Embriyo oluşumu sırasında, pankreas embriyonik gün dorsal ve ventral foregut endodermal fare embriyo ^3,4 (E) 9,5 farklı embriyonik çıkıntılar meydana gelmektedir. Hem çıkıntılar sağlam epitel olarak çevredeki mezenşimi içine tersyüz etmektam olgun organı ^2,5,6 oluşturmak için dallanma ve farklılaşması, proliferasyonu geçmesi l tomurcukları. Son bulgular insülin üreten β-hücreleri dahil olmak üzere pankreas hücre soylarının, büyüme ve farklılaşma dallanma pankreas epiteli ^7,8 içinde uygun doku mimarisi, epitel şekillenmesi ve hücre konumlandırma bağlıdır ileri sürmüşlerdir. Ancak, morfolojilerinden dallanma nasıl oluşur ve pankreasta proliferasyon ve farklılaşma ile koordine edilir ölçüde bilinmemektedir. Bu morfogenetik olaylar son derece dinamik ise bu gelişim süreçleri hakkında güncel bilgi, sabit numunelerinin analizi neredeyse sadece güvendi olması nedeniyle kısmen olduğunu.

Burada, diseksiyon ve gelişmekte olan pankreas (Şekil 1) doğrudan görüntülenmesine izin cam alt yemekleri hakkında kültürleme fare embriyonik pankreas tomurcukları ex vivo için bir yöntem sunulmuştur. Bu külture sistemi ideal Özellikle, canlı hücre görüntüleme, konfokal lazer tarama mikroskopi için tasarlanmış ve. Pankreatik eksplantlar, sadece yabani-tip fare embriyolarından hazırlanmış, fakat, aynı zamanda genetik mühendisliği fare suşu (örneğin, transgenik veya nakavt) için, mutant fenotipleri gerçek zamanlı çalışmalar sağlayan edilebilir. Dahası, bu ex vivo kültür sistemi çoğalması ve büyümesi, uzama, dallanma, tubulogenesis ve farklılaşması ile ilgili nicel veriler elde etmek sağlayan, pankreas gelişimi üzerinde kimyasal bileşiklerin etkilerini incelemek için değerlidir. Sonuç olarak, yüksek çözünürlüklü görüntüleme ile kombine bir ex vivo pankreas eksplant kültür yöntemi geliştirilmesi de gelişmekte olan fare embryo içinde meydana gibi morfogenetik ve farklılaşma olayları gözlemlemek için güçlü bir platform sağlar.

Protocol

Burada açıklanan protokol başlangıçta Percival ve Bolluk 9 açıklanan ve konfokal mikroskopi için optimize tekniği adapte edilmiştir. 1. Glass Bottom Kültür Yemekleri Kaplama Aşağıdaki adımları bir laminar akış başlık steril koşullar altında gerçekleştirilmelidir. Pankreas eksplantları 20-mm çaplı cam mikro alt (örneğin Mattek Corporation) ile 35 mm Petri kapları içinde kültüre. Eksplant kültür ba?…

Discussion

Pankreas kaderi belirtildiğinde sonra, pankreas progenitör hücreler sonunda olgun ve fonksiyonel bir organdır ^2,4 oluşturmak için kapsamlı çoğalma, farklılaşma ve morfonogenezi tabi. Şu anda, dallanma nasıl pankreas yer alır ve nasıl progenitör çoğalması ve farklılaşması bağlı büyük ölçüde bilinmemektedir. Pankreas eksplant kültürleri bu süreçlerin ex vivo ^5,9,11 aydınlatmak için ideal bir sistem temsil eder. Erken pankreas tomurcukları ex vivo …

Materials

Name of the reagent	Company	Catalogue number	Comments
Antibodies: Carboxypeptidase E-cadherin F-actin Glucagon Insulin β1-integrin Pdx1 Pdx1 Phospho-Histone H3	AbD Serotec Invitrogen Molecular Probes ImmunoStar Millipore Millipore Abcam Hybridoma bank Cell Signalling	1810-0006 13-1900 A-12373 20076 4011-01 MAB1997 ab47267 F109-D12 9706
Basal Medium Eagle (BME)	Sigma	B1522-500ML	Kept in sterile conditions
Cell culture grade water	PAA	S15-012	Kept in sterile conditions
Culture dishes (glass-bottomed), 35-mm	MatTek Corporation	P35G-0-20-C
Donkey Serum	Chemicon	S30-100 ml
Fetal calf serum Gold	PAA	A15-151	Kept in sterile conditions
Fibronectin	Invitrogen	330100-8	Stock sol. 1 mg/ml in cell culture grade water
Gentamicin	Invitrogen	15750-037	Kept in sterile conditions
Glutamine	Invitrogen	25030-024	Kept in sterile conditions
4-well Multidishes	Nunc	176740
Microscopes: Inverted Confocal Microscope (LSM 700) Stereomicroscope (Discovery V12)	Zeiss Zeiss		Objectives: C-Apochromat 10X / 0.45 W M27 (work. dist. 1.8 mm; imaging depth ~100 mm); C-Apochromat 40X / 1.2 W Corr M27 (work. dist. 0.28 mm; ~imaging depth 50 μm) Transillumination from below and fiber-optic illumination from above
Paraformaldehyde	Roth	0335.3	Stock solution 20%
Pasteur Pipet (Glass), 150 mm	VWR	HECH567/1
Penicillin/Streptomycin	PAA	P11-010	Kept in sterile conditions
Petri dishes, 60 mm	Greiner Bio-One	628102
Petri dishes, 35 mm	Greiner Bio-One	627161
1X PBS, pH7.4	PAA	H15-002	Kept in sterile conditions
Spring Scissors 8 mm blade curved	Fine Science Tools	15023-10
Triton-X100	Roth	3051.3
Watchmaker’s foreceps Dumont #5	Roth	K342.1