Heri beskrives procedurer, der gennemføres i Caffrey Membrane strukturelle og funktionelle Biologi Group til at høste og cryo-cool membran proteinkrystaller dyrket i lipidiske kubiske og svamp faser til brug i strukturbestemmelse hjælp makromolekylære røntgenkrystallografi.
En vigtig rute til at forstå, hvordan proteiner fungerer på en mekanistisk niveau er at have strukturen af målproteinet til rådighed, helst med atomar opløsning. For tiden er der kun en måde at fange sådanne oplysninger i forbindelse med integrerede membranproteiner (figur 1), og de komplekser, de danner, og denne metode er makromolekylær røntgenkrystallografi (MX). At gøre MX diffraktion kvalitet krystaller er brug som, i tilfælde af membranproteiner, ikke danner let. En metode til krystallisering membranproteiner, der involverer brugen af lipidiske mesofaser, især de kubiske og svamp faser 1-5, har fået betydelig opmærksomhed for sent på grund af de gode resultater, den har haft i G-protein-koblede receptor felt 6-21 ( www . mpdb.tcd.ie ). Men den metode, herefter benævnt i meso eller lipid kubisk fase metode, kommer med sin egen tekniskeudfordringer. Disse opstår til dels på grund af den generelt viskos og klæbrig karakter af den lipide mesofase, hvori krystallerne, som ofte mikrokrystaller, vokse. Manipulering krystaller bliver svært som et resultat og især så under høst 22,23. Problemer opstår også ved det trin, der går forud for høst hvorefter glasset sandwich-plader, som krystallerne vokser (fig. 2) 24,25 åbnes for at blotlægge mesofase bolus, og krystallerne deri, for høst, cryo-køling og eventuelle X -ray diffraction dataindsamling.
De kubiske og svamp mesofase varianter (Figur 3), hvorfra krystaller skal høstes har dybt forskellige rheologier 4,26. Den kubiske fase er viskos og klæbrig beslægtet med en tyk tandpasta. I modsætning hertil er svampen fase mere væske med en udpræget tendens til at flyde. Følgelig forskellige tilgange til åbning krystallisation brønde containing krystaller vokser i den kubiske og svampen fase kaldes for hvilket også forskellige metoder kræves til høstning krystaller fra de to mesofase typer. Protokoller for at gøre netop det er blevet raffineret og gennemført i membranen strukturelle og funktionelle Biology (MS & FB) gruppe, og er beskrevet i detaljer i denne Jové artikel (figur 4). Der gives eksempler på situationer, hvor krystaller er med held høstet og kryo-afkølet. Vi leverer også eksempler på tilfælde, hvor der er problemer, som fører til den uigenkaldeligt tab af krystaller og beskrive, hvordan disse problemer kan undgås. I denne artikel Viewer er forsynet med trin-for-trin instruktioner til åbning glas sandwich krystallisering brønde, til høst og for cryo-køling krystaller af membranproteiner vokser i kubiske og i svamp faser.
I denne video artikel viste vi, hvordan krystaller dyrket i en lipidisk mesofase høstes og cryo-afkølet som forberedelse til anvendelse ved diffraktion dataindsamling og i sidste ende til strukturbestemmelse. The hosting mesofase kan være viskos og klæbrig kubisk fase eller den mere flydende svamp fase 4. Hvordan glas sandwich plader er åbnet, og hvordan krystallerne høstes afhænger meget mesofase type. Det er derfor vigtigt at vide, hvilken af de to man har at gøre med i forvejen. Identiteten af den hosting lipid og den anvendte fældningsmiddel er vigtige i denne forbindelse, og den fysiske udseende af mesofase bolus i krystallisering godt kan bruges til at skelne dem fra hinanden (Figur 3). Høst fra begge mesofase typer blev illustreret i denne artikel.
Høst små krystaller fra en lipidisk mesofase i glas sandwich plader er en omhyggelig proces, der kræver tid, dygtighed, experience, tålmodighed og en rolig hånd. Det er vigtigt at afsætte en passende mængde tid til høst og til at oprette laboratoriet, så alle leverancer og udstyr er ved hånden i forvejen. En anden person til at hjælpe med høsten er ikke afgørende, men anbefales. Denne person kan hjælpe med at levere pre-mærkede plader til den enkelte at gøre høst samt at placere cryo-kølede monterede sløjfer med høstet krystaller i lageret pucken. Assistenten kan også spille en vigtig støtte rolle i at dokumentere observationer på de krystaller foretaget under høst, der kan vise sig afgørende i diffraktion dataindsamling. I mangel af en assistent, kunne en stemmeaktiveret audio-registreringsanordning med fordel anvendes til dokumentation.
Efter protokollen beskrevet i denne artikel vil hjælpe med at få Viewer op at køre med krystal høst. Det er imidlertid vigtigt at forstå, at processen ikke er ligetil og at PRActice er nødvendig, før lanceringen i høst værdifulde membran protein krystaller. Det anbefales derfor, at testplader med krystaller af proteiner, der ikke særlig værdifuld blive eksperimenteret med først. Dette vil give den neophyte med værdifuld erfaring i at skære glas, fjerne glasskår, løfter dækglas fra over mesofase ved hjælp af polariserende funktionen på mikroskop for at se krystaller og til at spore dem under høst, og endelig håndtering af de forskellige typer af mesofaser og høst fra dem. Teksturen af mesofase, og i forlængelse heraf den lethed, hvormed krystaller kan høstes, ændrer sig med tiden under krystallisation. Det er derfor vigtigt at øve høst med mindre værdifulde krystaller, men med dem, der er dyrket under de samme betingelser som de mere værdifulde. Det er muligt at dyrke krystaller af lysozym og thaumatin ved in meso eller lipid kubisk fase metode 28 og disse skal betragtestet af måde at få kendskab til de materialer og metode. Man bør også overveje at arbejde med protein-fri mesofase første til at lære af sine luner.
Procedurerne vist her blev alle udført i en behagelig 20 ° C eller deromkring. Det er muligt at dyrke krystaller med i meso metoden ved lavere temperaturer. Således kan monoolein som vært lipid i en metastabil fase tilstand anvendes ved 4 ° C 1,2,29,30. Et alternativ er at bruge rationelt designet 7,9 MAG for lav temperatur krystallisation 31. Vi gør lavtemperatur crysallogenesis rutinemæssigt med visse membran protein-targets. I dette tilfælde er krystalvækst og høstning gøres på en walk-in 4 ° C køleskab. Arbejde under sådanne forhold har sine egne udfordringer ikke mindst som er behovet for varm og komfortabel påklædning.
Det næste skridt i den overordnede proces for strukturbestemmelse hjælp makromolekylære krystaltallography er at indsamle diffraktionsdata om krystaller høstet og snap-afkølet som påvist i denne artikel. I meso-dyrket krystaller er normalt små. Imidlertid er nyttige diffraktion dataindsamling været muligt med krystaller med en maksimal dimension på 20 um 9. Til dette formål er mikro-beam synkrotron røntgenstråling anvendes og er genstand for et særskilt Jupiter artikel i denne serie 32,33.
The authors have nothing to disclose.
Der er mange, der har bidraget til dette arbejde, og de fleste er fra Caffrey Membrane strukturelle og funktionelle Biology Group, både tidligere og nuværende medlemmer. Til alle, og især til Jingquan Tan og Joseph Lyons, vi udvide vores varmeste tak og påskønnelse. Dette arbejde blev støttet delvist af tilskud fra Science Foundation Ireland (07/IN.1/B1836), National Institutes of Health (GM75915, P50GM073210 og U54GM094599), og FP7 COST og Marie Curie-aktioner (CM0902 og PIEF-GA-2009 -235.612).
Name of reagent | Company | Catalogue number | Components |
Curved tweezers | Sigma | F4142 | Tool |
Disposable pipette tips | Gilson | Various | Disposable |
Foam dewar | Spearlab | FD-500 | Tool |
Glass and metal waste containers | Daniels Healthcare | DD479OL | Tool |
Harvesting loops | MiTeGen | Various | Tool |
Harvesting microscope | Nikon | SMZ1500 | Tool |
Lab notebook | Various | NA | Tool |
Magnetic push button sample loading wand | Hampton Research/Molecular Dimensions | HR4-729/MD7-411 | Tool |
Original Puck (for use with ALS-style robots only) | Crystal Positioning Systems | CP-111-035 | Tool |
Pipetting devices | Gilson | Various | Tool |
Precipitant solutions | Various | Various | Reagent |
Puck Bent Cryo-Tong | Crystal Positioning Systems | CP-111-030 | Tool |
Puck Shelved Shipping Cane (original ALS-style) with hooked handle and locking rod | Crystal Positioning Systems | CP-111-029 | Tool |
Purified water | Millipore | Reagent | |
Safety goggles | Various | NA | Tool |
Sample Pin Bases – Magnetic (non-copper) | Crystal Positioning Systems | CP-111-015 | Tool |
Shipping dewar | Taylor-wharton | CX100 | Tool |
Tissues | NA | NA | Disposable |
Tungsten-carbide glass cutter (TCT Scriber) | Silverline Tools (Yeovil, UK) | 633657 | Tool |