Hierin beschreven procedures uitgevoerd in de Caffrey Membrane Biology Structurele en functionele groep te oogsten en cryo-cool membraaneiwit kristallen gegroeid lipidische kubieke spons fasen voor gebruik in structuurbepaling met macromoleculaire X-ray kristallografie.
Een belangrijke route voor het begrijpen hoe eiwitten functioneren op een mechanistisch niveau de structuur van het doeleiwit beschikken, idealiter op atomaire. Momenteel is er slechts een manier om dergelijke informatie te vangen als die welke integrale membraaneiwitten (figuur 1), en de complexen vormen, en deze methode is macromoleculaire X-ray kristallografie (MX). Doen MX diffractie kwaliteit kristallen die nodig bij membraaneiwitten, niet gemakkelijk te vormen. Werkwijze voor het kristalliseren membraaneiwitten dat het gebruik van lipidische mesofasen, met name de kubische en spons fase 1-5, gaat er veel aandacht gekregen van late Door de goede resultaten heeft gehad in de G-eiwit-gekoppelde receptor field 6-21 ( www . mpdb.tcd.ie ). De methode voortaan aangeduid als in meso of lipide kubische fase methode heeft zijn eigen technischeuitdagingen. Deze ontstaan, gedeeltelijk vanwege de algemeen viskeus en kleverig aard van de lipidische mesofase waarin de kristallen, die vaak micro-kristallen, groeien. Het manipuleren van kristallen wordt het moeilijk als gevolg en met name het geval tijdens het oogsten 22,23. Problemen ontstaan ook bij de stap die voorafgaat oogsten hetwelk de glazen platen sandwich waarin de kristallen groeien (Figuur 2) 24,25 zijn vanuit de mesofase bolus bloot, en de kristallen daarin, voor de oogst, cryo-koeling en eventueel X -ray diffractie gegevensverzameling.
De kubische en spons mesofase varianten (figuur 3) waaruit kristallen worden geoogst verschilt grondig rheologiën 4,26. De kubische fase is viskeus en kleverig verwant aan een dikke tandpasta. Daarentegen de spons fase meer vloeistof met een duidelijke tendens te stromen. Dienovereenkomstig verschillende benaderingen voor het openen van kristallisatie putten containing groeiende kristallen in de kubische fase en de spons zijn noodzakelijk zoals ook verschillende methoden nodig zijn voor het oogsten van de twee kristallen mesofase types. Protocollen voor het doen precies dat zijn verfijnd en geïmplementeerd in de membraan structuur-en Functionele Biologie (MS & FB)-groep, en worden in detail beschreven in dit Jove artikel (figuur 4). Voorbeelden gegeven van situaties waarin kristallen succes worden geoogst en cryo-gekoelde. We bieden ook voorbeelden van gevallen waarin problemen die leiden opstaan om het onherstelbare verlies van kristallen en beschrijven hoe deze problemen kunnen worden vermeden. In dit artikel wordt de Viewer is voorzien van stap-voor-stap instructies voor het openen van glas sandwich kristallisatie putten, voor het oogsten en voor cryo-koeling kristallen van membraaneiwitten groeien in kubieke en spons fasen.
In deze video artikel zullen we laten zien hoe kristallen gekweekt in een lipide mesofase worden geoogst en cryo-gekoeld in voorbereiding voor gebruik in diffractie het verzamelen van gegevens en uiteindelijk voor structuurbepaling. De hosting mesofase kan de viskeuze en kleverige kubieke fase of de meer vloeiende spons fase 4. Hoe de glazen sandwich platen worden geopend en hoe de kristallen worden vaak zeer geoogst is afhankelijk van mesofase type. Het is daarom belangrijk om te weten welke van de twee een te maken heeft met van tevoren. De identiteit van de ontvangende lipide en de gebruikte precipitatiemiddel zijn hierbij van belang, en het uiterlijk van de mesofase bolus in de kristallisatie goed gebruikt kunnen worden om ze uit elkaar (figuur 3). Oogsten van beide mesofase soorten werd geïllustreerd in dit artikel.
Oogsten kleine kristallen uit een lipide mesofase in glas sandwich platen is een secuur proces dat tijd, vaardigheid, expertise vereistveerkracht, geduld en een vaste hand. Het is belangrijk om vernietiging van een passende hoeveelheid tijd voor het oogsten en het opzetten van het laboratorium, zodat alle benodigdheden en de apparatuur bij de hand op voorhand. Een tweede persoon bij de oogst niet essentieel maar aanbevolen. Die persoon kan helpen met het leveren van pre-gemarkeerde platen op de individuele het doen van de oogst en het plaatsen van cryo-gekoelde gemonteerd lussen met geoogst kristallen in de opslag puck. De assistent kan een belangrijke ondersteunende rol spelen bij het documenteren van opmerkingen over de kristallen gemaakt tijdens het oogsten die kunnen van doorslaggevend belang zijn tijdens de diffractie het verzamelen van gegevens. In afwezigheid van een assistent kan een spraakgestuurd audio-opnameapparaat met voordeel worden toegepast voor documentatie.
Naar aanleiding van het protocol beschreven in dit artikel zal helpen om de Viewer up and running met kristal oogsten. Het is echter belangrijk te beseffen dat het proces niet eenvoudig is en dat practice is nodig voor de lancering in het oogsten van waardevolle membraaneiwit kristallen. Het wordt daarom aanbevolen dat testplaten met kristallen van eiwitten die niet zijn bijzonder waardevol worden geëxperimenteerd met de eerste. Dit zal de neofiet waardevolle ervaring in het snijden van glas, verwijderen glasscherven, tillen de coverglass van de mesofase, met de functie op de polariserende microscoop kristallen zien en te volgen tijdens het oogsten en tenslotte de behandeling van de verschillende mesofasen en het oogsten van hen. De textuur van de mesofase en bij uitbreiding het gemak waarmee kristallen kunnen worden geoogst, verandert met de tijd tijdens kristallisatie. Het is daarom belangrijk om te oefenen oogsten met minder waardevolle kristallen maar die zijn gegroeid onder dezelfde voorwaarden als die waardevoller. Het is mogelijk om kristallen van lysozyme en thaumatine groeien in de meso of lipide kubische fase methode 28 die dient te worden considEred door middel van het verkrijgen van bekendheid met de materialen en de methode. Men moet ook rekening houden met het werken met eiwit-vrij mesofase eerste op de van haar grillen.
De procedures toonde hier zijn allemaal gedaan op een comfortabele 20 ° C of daaromtrent. Het is mogelijk om de kristallen groeien met de in meso werkwijze bij lagere temperaturen. Aldus kan monooleïne de gastheer lipide in een metastabiele fase toestand worden gebruikt bij 4 ° C 1,2,29,30. Als alternatief kunnen de rationeel ontworpen 7,9 MAG gebruiken bij lage temperatuur kristallisatie 31. We doen lage temperatuur crysallogenesis routinematig met bepaalde membraaneiwit doelstellingen. In dit geval wordt kristalgroei en oogsten gedaan in een walk-in 4 ° C koelkast. Werken onder dergelijke omstandigheden heeft zijn eigen uitdagingen niet de minste daarvan is de behoefte aan warme en comfortabele kleding.
De volgende stap in het totale proces van de structuur van de bepaling met behulp van macromoleculaire crystallography is om diffractie gegevens te verzamelen over kristallen geoogst en snap-gekoeld zoals aangetoond in dit artikel. In meso-grown kristallen meestal klein zijn. Echter nuttig diffractie gegevensverzameling mogelijk met kristallen met een maximale afmeting van 20 pm 9. Hiertoe wordt micro-beam synchrotron X-straling gebruikt en is het onderwerp van een afzonderlijke Jupiter artikel in deze serie 32,33.
The authors have nothing to disclose.
Er zijn velen die hebben bijgedragen aan dit werk en de meeste zijn uit de Caffrey Membraan Structurele en Functionele Biologie Groep, zowel in het verleden en huidige leden. Voor iedereen, en vooral voor Jingquan Tan en Joseph Lyons, breiden we onze hartelijke dank en waardering. Dit werk werd gedeeltelijk ondersteund door subsidies van Science Foundation Ierland (07/IN.1/B1836), de National Institutes of Health (GM75915, P50GM073210 en U54GM094599), en KP7 COST en Marie Curie-acties (CM0902 en PIEF-GA-2009 -235.612).
Name of reagent | Company | Catalogue number | Components |
Curved tweezers | Sigma | F4142 | Tool |
Disposable pipette tips | Gilson | Various | Disposable |
Foam dewar | Spearlab | FD-500 | Tool |
Glass and metal waste containers | Daniels Healthcare | DD479OL | Tool |
Harvesting loops | MiTeGen | Various | Tool |
Harvesting microscope | Nikon | SMZ1500 | Tool |
Lab notebook | Various | NA | Tool |
Magnetic push button sample loading wand | Hampton Research/Molecular Dimensions | HR4-729/MD7-411 | Tool |
Original Puck (for use with ALS-style robots only) | Crystal Positioning Systems | CP-111-035 | Tool |
Pipetting devices | Gilson | Various | Tool |
Precipitant solutions | Various | Various | Reagent |
Puck Bent Cryo-Tong | Crystal Positioning Systems | CP-111-030 | Tool |
Puck Shelved Shipping Cane (original ALS-style) with hooked handle and locking rod | Crystal Positioning Systems | CP-111-029 | Tool |
Purified water | Millipore | Reagent | |
Safety goggles | Various | NA | Tool |
Sample Pin Bases – Magnetic (non-copper) | Crystal Positioning Systems | CP-111-015 | Tool |
Shipping dewar | Taylor-wharton | CX100 | Tool |
Tissues | NA | NA | Disposable |
Tungsten-carbide glass cutter (TCT Scriber) | Silverline Tools (Yeovil, UK) | 633657 | Tool |