تجميد مستورقة، التشعيع جزئي، والنسج
Summary
وصفت وسيلة فعالة لتطعيم الأنسجة من حجم محدد وثابت بين المستورقات. كما تضمنت وصفا للطريقة التي يمكن أن تتكيف تقنية تجميد المستخدمة لزراعة الأعضاء، وبالتزامن مع دروع الرصاص، لتشعيع جزئي للحيوانات الحية.
Abstract
أثبت مستورقة، والديدان والمياه العذبة، ليكون نظاما قويا للتشريح تجديد metazoan و 1،2 بيولوجيا الخلايا الجذعية. يتم تجديد مستورقة من أي الأنسجة المفقودة أو التالفة ممكن من الخلايا الجذعية البالغة ووصف neoblasts 3. وعلى الرغم من هذه الخلايا الجذعية أظهرت بشكل قاطع أن تكون ذات قوة تناسلية متعددة وقادرة على إعادة تشكيل متفرد من حيوان كامل 4، وعدم التجانس داخل الخلية الجذعية السكان وديناميات تصرفاتهم الخلوية لا تزال دون حل إلى حد كبير. نظرا للعدد الكبير وتوزيع واسعة من الخلايا الجذعية في جميع أنحاء الجسم مستورقة خطة، وهناك حاجة إلى أساليب متقدمة لمعالجة جزء من السكان الخلايا الجذعية لدراسة الجزيئية والوظيفية في الجسم الحي.
زراعة الأنسجة والتشعيع جزئي طريقتان يمكن من خلالها عزل جزء من السكان للخلايا الجذعية مستورقة لمزيد من الدراسة. كل تقنية لها مزايا واضحة. تيزرع قضية تسمح لإدخال الخلايا الجذعية، إلى مجموعة من السذاجة، التي إما أن تكون بطبيعتها المتميزة وراثيا أو قد تمت معالجتها من قبل دواء. بدلا من ذلك، التشعيع جزئي يسمح لعزل الخلايا الجذعية ضمن مجموعة، جنبا إلى جنب إلى الأنسجة خالية من الخلايا الجذعية، من دون إدخال أي جرح أو المؤخرة في سلامة الأنسجة. باستخدام هاتين الطريقتين، يمكن للمرء أن التحقيق في العوامل خلية مستقلة وغير مستقلة، أن وظائف التحكم في الخلايا الجذعية، مثل انتشار الأسلحة النووية، والتمايز، والهجرة.
وقد استخدمت كل من زرع أنسجة 5،6 وجزئية تشعيع 7 تاريخيا في تحديد العديد من الأسئلة حول تجديد مستورقة التي لا تزال قيد الدراسة اليوم. ومع ذلك، ظلت هذه التقنيات بالشكل الكافي نظرا لطبيعة شاقة وغير متناسقة من الطرق السابقة. البروتوكولات المعروضة هنا تمثل خطوة كبيرة إلى الأمام في خفض الوقتالثانية والجهد اللازم لتوليد بتكاثر أعداد كبيرة من الحيوانات المطعمة أو المشع جزئيا مع efficacies تقترب من 100 في المئة. نحن تغطي ثقافة الحيوانات الكبيرة، الشلل، والتحضير لتشعيع جزئي، وزرع الأنسجة، وتعظيم الاستفادة من انتعاش الحيوانية. وعلاوة على ذلك، فإن العمل الموصوفة هنا يظهر أول تطبيق للطريقة التشعيع جزئي للاستخدام مع معظم مستورقة درس على نطاق واسع، Schmidtea البحر الأبيض المتوسط. بالإضافة إلى ذلك، الأنسجة كفاءة التطعيم في المستورقات يفتح الباب امام اختبار وظيفي من مجموعات سكانية فرعية من الخلايا الجذعية من السذاجة أو المعالجة في إعادة تعمير المقايسات، التي طالما كانت طريقة الذهب القياسية من يعاير الكبار المحتملة الخلايا الجذعية في الثدييات 8. وسوف تبني واسع من هذه التقنيات مما لا شك فيه تؤدي إلى فهم أفضل للسلوكيات الخلوية من خلايا جذعية للبالغين خلال توازن الأنسجة وتجديدها.
Protocol
Discussion
أهمية من الشلل
الشلل هو الى حد بعيد الخطوة الأكثر أهمية لإنجاز أي من هذه العمليات. إذا ثبتوا بشكل غير صحيح المستورقات قبل التشعيع جزئي، فإنها قد تحرك تحت درع الرصاص، وتسفر عن نتائج غير متسقة والتباس. وبالإضافة إلى ذلك، إذا لم يجمد ك…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
فإن الكتاب أود أن أشكر Chiyoko كوباياشي وأجاتا Kiyokazu للحصول على المشورة المفيدة حول زرع مستورقة فضلا عن أعضاء في الماضي والحاضر من المختبر سانشيز لإجراء مناقشات لا تقدر بثمن خلال تطوير هذه التقنيات. وأيد هذا العمل من قبل المعاهد الوطنية للصحة تدريب جرانت (5T32 HD0791) لمكتب المراقب المالي العام والمعاهد الوطنية للصحة R37GM057260 إلى ASA. ASA هو الباحث بمعهد هوارد هيج الطبي.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number |
| General Purpose Transfer Pipette | Samco | 691 |
| Capillary tubes (ID 0.75 mm) | FHC | 30-30-0 |
| Capillary tubes (OD 0.7 mm) | FHC | 30-50-08 |
| Parafilm M | VWR | 52858-076 |
| Kimwipes 34155 | VWR | 500029-891 |
| Black filter paper | Schleicher & Schuell | 10310809 |
| Whatman #2 filter paper 1002-055 | Fisher Scientific | 09-810B |
| Whatman #3 filter paper 1003-185 | Fisher Scientific | 09-820E |
| Cigarette rolling paper | Zig-Zag, original | NA |
| Petri dishes | VWR | 82050-544 |
| Forceps DUMONT, INOX #5 | FST | 11251-20 |
| Chloretone | Sigma Aldrich | 112054 |
| Casein | Sigma Aldrich | C3400 |
| Lead Shields | Alpha Systems Corp., Bluffdale, UT | Custom design |
| XRAD-320 Biological Irradiator | Precision X-Ray, North Branford, CT | NA |
References
- Morgan, T. Experimental studies of the regeneration of Planaria maculata. Arch. Entw. Mech. Org. 7, 364-397 .
- Reddien, P. W., Sanchez Alvarado, A. Fundamentals of planarian regeneration. Annu Rev Cell Dev Biol. 20, 725-757 (2004).
- Randolph, H. The regeneration of the tail in lumbriculus. J. Morphol. 7, 317-344 .
- Wagner, D. E., Wang, I. E., Reddien, P. W. Clonogenic neoblasts are pluripotent adult stem cells that underlie planarian regeneration. Science. 332, 811-816 (2011).
- Santos, F. Studies on transplantation in planaria. Biological Bulletin. 57, 188-197 (1929).
- Morgan, L. Regeneration of grafted pieces of planarians. J. Exp. Zoöl. 3, 269-294 (1906).
- Dubois, F. Contribution á l ‘ètude de la migration des cellules de règènèration chez les Planaires dulcicoles. Bull. Biol. Fr. Belg. 83, 213-283 (1949).
- Purton, L. E., Scadden, D. T. Limiting factors in murine hematopoietic stem cell assays. Cell Stem Cell. 1, 263-270 (2007).
- Cebria, F., Newmark, P. A. Planarian homologs of netrin and netrin receptor are required for proper regeneration of the central nervous system and the maintenance of nervous system architecture. Development. , 132-3691 (2005).
- Newmark, P. A., Sánchez Alvarado, A. Bromodeoxyuridine specifically labels the regenerative stem cells of planarians. Dev. Biol. 220, 142-153 (2000).
- Miller, W., Kennedy, R. J. X-ray attenuation in lead, aluminum, and concrete in the range 275 to 525 kilovolts. Radiology. 65, 920-925 (1955).
- Pearson, B. J. Formaldehyde-based whole-mount in situ hybridization method for planarians. Dev. Dyn. 238, 443-450 (2009).
- Hayashi, T., Asami, M., Higuchi, S., Shibata, N., Agata, K. Isolation of planarian X-ray-sensitive stem cells by fluorescence-activated cell sorting. Dev. Growth Differ. 48, 371-380 (2006).
- Reddien, P. W., Oviedo, N. J., Jennings, J. R., Jenkin, J. C., Sánchez Alvarado, A. SMEDWI-2 is a PIWI-like protein that regulates planarian stem cells. Science. 310, 1327-1330 (2005).
- Stéphan-Dubois, F. Les cellules de régénération chez la planaire Dendrocoleum lacteum. Bulletin de la Société Zooologique de France. 86, 172-185 (1961).
- Gurley, K. A. Expression of secreted Wnt pathway components reveals unexpected complexity of the planarian amputation response. Dev. Biol. 347, 24-39 (2010).
- Salvetti, A. Adult stem cell plasticity: neoblast repopulation in non-lethally irradiated planarians. Dev. Biol. 328, 305-314 (2009).
