Planarian Immobilisering, partiell bestrålning, och vävnadstransplantation
Summary
En effektiv metod för ympning av vävnad definierad och enhetlig storlek mellan planaria beskrivs. Dessutom ingår en beskrivning av hur immobilisering som används för transplantation kan anpassas i samband med bly sköldar, för den partiella bestrålning av levande djur.
Abstract
Den planarian, en sötvattens plattmask, har visat sig vara ett kraftfullt system för dissekera flercelliga förnyelse och stamcellsbiologi 1,2. Planarian regenerering av alla saknade eller skadade vävnader görs möjligt genom adulta stamceller kallas neoblasts 3. Även om dessa stamceller har definitivt visat sig vara pluripotenta och i singularis kan rekonstruera en hel djur 4, heterogenitet inom stamceller befolkningen och dynamiken i deras cellulära beteenden i stort sett olösta. Grund av det stora antalet och stor spridning av stamceller i hela kroppen planarian plan är avancerade metoder för att manipulera subpopulationer av stamceller för molekylär och funktionella studier in vivo behövs.
Vävnadstransplantation och partiell bestrålning är två metoder genom vilka en subpopulation av planarian stamceller kan isoleras för ytterligare studium. Varje teknik har olika fördelar. TFrågan transplantation tillåter introduktion av stamceller, in i en naiv värd, som är antingen i sig genetiskt distinkt eller tidigare har behandlats farmakologiskt. Alternativt kan partiell bestrålning för isolering av stamceller i en värd, placerad intill vävnad som saknar stamceller, utan införande av ett sår eller någon bakstyckskammaren i vävnadsintegritet. Med hjälp av dessa två metoder kan man undersöka cell autonoma och icke-självständiga faktorer som styr stamceller funktioner såsom proliferation, differentiering och migration.
Både vävnadstransplantation 5,6 och partiell bestrålning 7 har använts historiskt för att definiera många av de frågor om planarian förnyelse som finns kvar under utredning i dag. Emellertid har dessa tekniker förblivit underanvända på grund av det mödosamma och inkonsekvent typ av tidigare metoder. Protokollen som presenteras här utgör ett stort steg framåt i att minska tiden ennd ansträngning krävs för att reproducerbart generera ett stort antal ympade eller partiellt bestrålade djur med effektiviteter som närmar 100 procent. Vi täcker kulturen av stora djur, immobilisering, förberedelse för partiell bestrålning, vävnad transplantation, och optimering av djur återhämtning. Dessutom visar det arbete som beskrivs här den första tillämpningen av den partiella bestrålning för användning med det mest studerade planarian, Schmidtea Mediterranea. Dessutom öppnar effektiv vävnadstransplantation i planaria dörren för funktionell testning av subpopulationer av naiva eller behandlad stamceller i återinplantering av analyser, som länge har varit guld-standarden metod för att analysera vuxna potential stamceller hos däggdjur 8. Omfattande införande av dessa tekniker kommer utan tvekan att leda till en bättre förståelse av de cellulära beteenden hos vuxna stamceller under vävnadshomeostas och förnyelse.
Protocol
Discussion
Betydelsen av immobilisering
Immobilisering är den i särklass mest kritiska steget för ett framgångsrikt slutförande av någon av dessa processer. Om planaria är felaktigt immobiliseras före partiell bestrålning, kan de röra sig under blyskärm, som producerar inkonsekventa och confounding resultat. Dessutom, om djuren inte är tillräckligt immobiliserade efter transplantation, kommer värden masken rör sig sannolikt från transplantatvävnad, vilket resulterar i ett fel i transplant…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Författarna vill tacka Chiyoko Kobayashi och Kiyokazu Agata för goda råd om planarian transplantation samt tidigare och nuvarande medlemmar i Sánchez labb för ovärderliga diskussioner under utvecklingen av dessa tekniker. Detta arbete stöddes av NIH Training Grant (5T32 HD0791) att OCG och NIH R37GM057260 till ASA. ASA är en Howard Hughes Medical Institute Investigator.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number |
| General Purpose Transfer Pipette | Samco | 691 |
| Capillary tubes (ID 0.75 mm) | FHC | 30-30-0 |
| Capillary tubes (OD 0.7 mm) | FHC | 30-50-08 |
| Parafilm M | VWR | 52858-076 |
| Kimwipes 34155 | VWR | 500029-891 |
| Black filter paper | Schleicher & Schuell | 10310809 |
| Whatman #2 filter paper 1002-055 | Fisher Scientific | 09-810B |
| Whatman #3 filter paper 1003-185 | Fisher Scientific | 09-820E |
| Cigarette rolling paper | Zig-Zag, original | NA |
| Petri dishes | VWR | 82050-544 |
| Forceps DUMONT, INOX #5 | FST | 11251-20 |
| Chloretone | Sigma Aldrich | 112054 |
| Casein | Sigma Aldrich | C3400 |
| Lead Shields | Alpha Systems Corp., Bluffdale, UT | Custom design |
| XRAD-320 Biological Irradiator | Precision X-Ray, North Branford, CT | NA |
References
- Morgan, T. Experimental studies of the regeneration of Planaria maculata. Arch. Entw. Mech. Org. 7, 364-397 .
- Reddien, P. W., Sanchez Alvarado, A. Fundamentals of planarian regeneration. Annu Rev Cell Dev Biol. 20, 725-757 (2004).
- Randolph, H. The regeneration of the tail in lumbriculus. J. Morphol. 7, 317-344 .
- Wagner, D. E., Wang, I. E., Reddien, P. W. Clonogenic neoblasts are pluripotent adult stem cells that underlie planarian regeneration. Science. 332, 811-816 (2011).
- Santos, F. Studies on transplantation in planaria. Biological Bulletin. 57, 188-197 (1929).
- Morgan, L. Regeneration of grafted pieces of planarians. J. Exp. Zoöl. 3, 269-294 (1906).
- Dubois, F. Contribution á l ‘ètude de la migration des cellules de règènèration chez les Planaires dulcicoles. Bull. Biol. Fr. Belg. 83, 213-283 (1949).
- Purton, L. E., Scadden, D. T. Limiting factors in murine hematopoietic stem cell assays. Cell Stem Cell. 1, 263-270 (2007).
- Cebria, F., Newmark, P. A. Planarian homologs of netrin and netrin receptor are required for proper regeneration of the central nervous system and the maintenance of nervous system architecture. Development. , 132-3691 (2005).
- Newmark, P. A., Sánchez Alvarado, A. Bromodeoxyuridine specifically labels the regenerative stem cells of planarians. Dev. Biol. 220, 142-153 (2000).
- Miller, W., Kennedy, R. J. X-ray attenuation in lead, aluminum, and concrete in the range 275 to 525 kilovolts. Radiology. 65, 920-925 (1955).
- Pearson, B. J. Formaldehyde-based whole-mount in situ hybridization method for planarians. Dev. Dyn. 238, 443-450 (2009).
- Hayashi, T., Asami, M., Higuchi, S., Shibata, N., Agata, K. Isolation of planarian X-ray-sensitive stem cells by fluorescence-activated cell sorting. Dev. Growth Differ. 48, 371-380 (2006).
- Reddien, P. W., Oviedo, N. J., Jennings, J. R., Jenkin, J. C., Sánchez Alvarado, A. SMEDWI-2 is a PIWI-like protein that regulates planarian stem cells. Science. 310, 1327-1330 (2005).
- Stéphan-Dubois, F. Les cellules de régénération chez la planaire Dendrocoleum lacteum. Bulletin de la Société Zooologique de France. 86, 172-185 (1961).
- Gurley, K. A. Expression of secreted Wnt pathway components reveals unexpected complexity of the planarian amputation response. Dev. Biol. 347, 24-39 (2010).
- Salvetti, A. Adult stem cell plasticity: neoblast repopulation in non-lethally irradiated planarians. Dev. Biol. 328, 305-314 (2009).
