Summary

En electroporación in ovo en el mesencéfalo polluelo para estudiar la función génica en el desarrollo neuronal dopaminérgica

Published: August 03, 2012
doi:

Summary

Para evaluar la función y la regulación de los genes durante el desarrollo de las neuronas del cerebro medio dopaminérgico, se describe un método que consiste en<em> In ovo</em> Electroporación de construcciones de ADN plásmido en células progenitoras embrionarias de pollo ventral del cerebro medio de neuronas dopaminérgicas. Esta técnica puede utilizarse para lograr la expresión eficiente de genes de interés para estudiar diferentes aspectos del desarrollo y diferenciación de las neuronas del mesencéfalo dopaminérgica.

Abstract

Las neuronas dopaminérgicas en el movimiento del mesencéfalo ventral de control, el comportamiento emocional y los mecanismos de recompensa 1-3. La disfunción de las neuronas dopaminérgicas del mesencéfalo ventral, está implicado en la enfermedad de Parkinson, la esquizofrenia, la depresión y la demencia 1-5. De este modo, el estudio de la regulación de la diferenciación de las neuronas dopaminérgicas del mesencéfalo, no sólo podría proporcionar información importante sobre los mecanismos que regulan el desarrollo del cerebro medio y la especificación progenitoras neurales destino, sino también ayudar a desarrollar nuevas estrategias terapéuticas para el tratamiento de una variedad de trastornos neurológicos humanos.

Las neuronas dopaminérgicas diferenciarse de progenitores neurales que recubren la zona ventricular del cerebro medio ventral embrionario. El desarrollo de progenitores neurales está controlado por programas de expresión génica 6,7. Aquí mostramos las técnicas que utilizan la electroporación para expresar los genes específicamente en el cerebro medio de Hamburger y Hamilton (HH) la 11 ª etapa (tsomitas irteen, 42 horas), los embriones de pollo 8,9. El desarrollo de embriones de pollo externa permite convenientes manipulaciones experimentales en determinadas etapas embrionarias, con los efectos determinados en los puntos de tiempo posteriores del desarrollo 10-13. Polluelo de tubos neurales embrionarias antes del estadio HH 13 (diecinueve somitas, 48 ​​horas) consistirá en multipotenciales progenitoras neuronales que son capaces de diferenciarse en distintos tipos de células del sistema nervioso. El vector pCAG, que contiene tanto un promotor de CMV y un polluelo β-actina potenciador, permite la expresión robusta de la bandera o otras construcciones etiquetados epítopo en tubos de embriones de pollo neural 14. En este informe, hacemos hincapié en las medidas especiales para lograr la expresión de genes regional restringido en mesencéfalo dopaminérgicas embrionarias progenitoras neuronales, incluyendo cómo inyectar ADN construye específicamente en la región del cerebro medio embrionario y cómo identificar electroporación con pequeños electrodos hechos a la medida. El análisis de ccerebro medio cateto en etapas posteriores ofrece un excelente sistema in vivo para el plásmido vector-mediado por el aumento de la función y la pérdida de la función de los estudios del desarrollo del cerebro medio. La modificación del sistema experimental puede extender el ensayo a otras partes del sistema nervioso para realizar análisis destino mapeo y para investigar la regulación de la expresión génica.

Protocol

1. Suministro preparación (no en vídeo) Preparar una dilución nueva 1X de penicilina / estreptomicina (Pen / Strep) en 1X PBS. No más de 50 mL es necesario. Filtrar con un filtro de 0,22 micras jeringa. Preparar las construcciones de inyección mediante la combinación de construcciones de plásmidos deseados. Ponemos todas las construcciones en el vector pCAG-Bandera con estequiometría apropiada para un volumen final de ~ 10 l. Además, pCAG-GFP 14 o pCAG mCherry-se debe agregar par…

Discussion

La electroporación in ovo en el cerebro medio de los embriones de pollo ofrece una alternativa de bajo costo y rápida a la generación de animales transgénicos o knockout para realizar el estudio in vivo de las funciones de los genes en el cerebro medio dopaminérgico el desarrollo neuronal. Usando corto 2 mm de electrodos de platino largos en forma de L, junto con la inyección de ADN embrionario mesencéfalo-específico es la clave para lograr una expresión eficaz del gen de interés en …

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Agradecemos al Dr. Takahiko Matsuda para la prestación del pCAG-mCherry construir. YCM está respaldada por un premio de Desarrollo de la Carrera de la Fundación Schweppe y una beca de la Fundación Whitehall.

Materials

Name of the reagent Company Catalogue Number Comments
Fertilized chicken eggs Charles River Laboratories    
Egg incubator GQF Manufacturing 1502 Sportsman  
BTX Electroporator BTX Harvard Apparatus ECM830  
Electrodes BTX Harvard Apparatus 45-0162 L-shaped genetrodes For use with ECM830 electroporator
Platinum iridium wire Alfa Aesar #10056 0.5 mm diameter
For making the 2 mm long electrodes
Glass capillary tube World Precision Instrument TW100F-4  
Microloader pipette tip Eppendorf 5242 956.003  
India ink Staples   Filter 20% before use
Microinjector Parker Automation,
Parker Hannifin Cooperation
Picospritzer III  
Fluorescent dissection microscope Leica MZ16F  
Micropipette puller Sutter Instrument D-97  

References

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Cite This Article
Yang, B., Geary, L. B., Ma, Y. In ovo Electroporation in Chick Midbrain for Studying Gene Function in Dopaminergic Neuron Development. J. Vis. Exp. (66), e4017, doi:10.3791/4017 (2012).

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