In ovo Elektroporatie in Chick middenhersenen voor het bestuderen van gen-functie in dopaminerge Neuron Ontwikkeling
Summary
Om de functie en de regulatie van genen tijdens de ontwikkeling van middenhersenen dopaminerge neuronen te beoordelen, beschrijven we een methode die inhoudt dat<em> In ovo</em> Elektroporatie van plasmide DNA-constructen in het embryonale kuiken ventrale middenhersenen dopaminerge neuronen voorouders. Deze techniek kan worden gebruikt om efficiënte expressie van genen van interesse te bereiken verschillende aspecten van middenhersenen ontwikkeling dopaminerge differentiatie te bestuderen.
Abstract
Dopaminerge neuronen in het ventrale middenhersenen controle beweging, emotioneel gedrag en beloning mechanismen 1-3. Het disfunctioneren van ventrale middenhersenen dopaminerge neuronen betrokken is bij de ziekte van Parkinson, schizofrenie, depressie en dementie 1-5. Zo kon het bestuderen van de regulering van de middenhersenen dopaminerge neuron differentiatie niet alleen belangrijk inzicht in de mechanismen tot regeling van middenhersenen ontwikkeling en neurale voorlopercellen lot specificatie, maar ook de ontwikkeling van nieuwe therapeutische strategieën voor de behandeling van een verscheidenheid van menselijke neurologische aandoeningen.
Dopaminerge neuronen te onderscheiden van neurale voorlopercellen langs de ventriculaire zone van de embryonale ventrale middenhersenen. De ontwikkeling van neurale voorlopercellen wordt gecontroleerd door genexpressie-programma's 6,7. Hier melden wij technieken gebruik te maken van elektroporatie om specifiek te uiten genen in de middenhersenen van Hamburger Hamilton (HH) etappe 11 (eirteen somieten, 42 uur) kippenembryo's 8,9. De externe ontwikkeling van kippenembryo's zorgt voor een handige experimentele manipulaties op specifieke embryonale stadia, met de effecten die op een later ontwikkelingstijd punten 10-13. Chick embryonale neurale buizen eerder dan HH stadium 13 (negentien somieten, 48 uur) bestaat uit multipotente neurale voorlopercellen die in staat zijn te differentiëren in verschillende celtypes van het zenuwstelsel. De pCAG vector, die zowel een CMV-promotor en een chick β-actine enhancer bevat, zorgt voor een krachtige uiting van vlag of een andere epitoop-gemerkte constructen in embryonale kuiken neurale buizen 14. In dit rapport, benadrukken we speciale maatregelen voor de regionale beperkte genexpressie te bereiken in embryonale middenhersenen dopaminerge neuron voorouders, met inbegrip van hoe te injecteren DNA-constructen in het bijzonder in de embryonale middenhersenen regio en hoe elektroporatie lokaliseren met kleine custom-made elektroden. Het analyseren van cHick middenhersenen later stadium een uitstekende in vivo voor plasmide vector-gemedieerde gain-of-functie en verlies-van-functie studies van middenhersenen ontwikkeling. Wijziging van de experimentele systeem kan verlengen assay naar andere delen van het zenuwstelsel voor het uitvoeren lot mapping analyse en onderzoeken van de regulering van de genexpressie.
Protocol
Discussion
De in ovo elektroporatie van embryonale kuiken middenhersenen biedt lage kosten en snel alternatief voor het genereren van transgene of knockout dieren te voeren in vivo studie genfuncties in middenhersenen dopaminerge ontwikkeling. Met korte 2 mm L-vormige platina elektroden met embryonale middenhersenen specifieke DNA injectie is het van essentieel belang om efficiënte expressie van het gen van interesse in middenhersenen dopaminerge progenitors. Daarnaast, met behulp van de juiste HH stadium 11 kip…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wij danken Dr Takahiko Matsuda voor het verstrekken van pCAG-mCherry te bouwen. YCM wordt ondersteund door een Career Development Award van de Schweppe Foundation en een subsidie van de Whitehall Foundation.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue Number | Comments |
| Fertilized chicken eggs | Charles River Laboratories | ||
| Egg incubator | GQF Manufacturing | 1502 Sportsman | |
| BTX Electroporator | BTX Harvard Apparatus | ECM830 | |
| Electrodes | BTX Harvard Apparatus | 45-0162 L-shaped genetrodes | For use with ECM830 electroporator |
| Platinum iridium wire | Alfa Aesar | #10056 | 0.5 mm diameter For making the 2 mm long electrodes |
| Glass capillary tube | World Precision Instrument | TW100F-4 | |
| Microloader pipette tip | Eppendorf | 5242 956.003 | |
| India ink | Staples | Filter 20% before use | |
| Microinjector | Parker Automation, Parker Hannifin Cooperation |
Picospritzer III | |
| Fluorescent dissection microscope | Leica | MZ16F | |
| Micropipette puller | Sutter Instrument | D-97 |
References
- Wightman, R. M., Robinson, D. L. Transient changes in mesolimbic dopamine and their association with ‘reward’. J. Neurochem. 82, 721-735 (2002).
- Kelley, A. E., Berridge, K. C. The neuroscience of natural rewards: relevance to addictive drugs. J. Neurosci. 22, 3306-3311 (2002).
- Moore, D. J., West, A. B., Dawson, V. L., Dawson, T. M. Molecular pathophysiology of Parkinson’s disease. Annu. Rev. Neurosci. 28, 57-87 (2005).
- Dailly, E., Chenu, F., Renard, C. E., Bourin, M. Dopamine, depression and antidepressants. Fundam. Clin. Pharmacol. 18, 601-607 (2004).
- Sesack, S. R., Carr, D. B. Selective prefrontal cortex inputs to dopamine cells: implications for schizophrenia. Physiol. Behav. 77, 513-517 (2002).
- Ang, S. L. Transcriptional control of midbrain dopaminergic neuron development. Development. 133, 3499-3506 (2006).
- Andersson, E. Identification of intrinsic determinants of midbrain dopamine neurons. Cell. 124, 393-405 (2006).
- Hamburger, V., Hamilton, H. L. A Series of Normal Stages in the Development of the Chick Embryo. J. Morphol. 88, 49 (1951).
- Bellairs, R., Osmond, M. . The atlas of chick development. , (2005).
- Itasaki, N., Bel-Vialar, S., Krumlauf, R. ‘Shocking’ developments in chick embryology: electroporation and in ovo gene expression. Nat. Cell Biol. 1, 203-207 (1999).
- Momose, T. Efficient targeting of gene expression in chick embryos by microelectroporation. Dev. Growth Differ. 41, 335-344 (1999).
- Muramatsu, T., Mizutani, Y., Ohmori, Y., Okumura, J. Comparison of three nonviral transfection methods for foreign gene expression in early chicken embryos in ovo. Biochem. Biophys. Res. Commun. 230, 376-380 (1997).
- Nishi, T. High-efficiency in vivo gene transfer using intraarterial plasmid DNA injection following in vivo electroporation. Cancer Res. 56, 1050-1055 (1996).
- Matsuda, T., Cepko, C. L. Electroporation and RNA interference in the rodent retina in vivo and in vitro. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101, 16-22 (2004).
- Blank, M. C., Chizhikov, V., Millen, K. J. In Ovo Electroporations of HH Stage 10 Chicken Embryos. J. Vis. Exp. (9), e408 (2007).
- Chesnutt, C., Niswander, L. Plasmid-based short-hairpin RNA interference in the chicken embryo. Genesis. 39, 73-78 (2004).
