I ovo Elektroporation i Chick midthjernen for at studere genfunktion i dopaminerg Neuron Development
Summary
At vurdere funktionen og reguleringen af gener under udviklingen af midthjerne-dopaminerge neuroner, beskriver vi en fremgangsmåde, der involverer<em> In ovo</em> Elektroporering af plasmid-DNA-konstruktioner i embryoniske kyllinge ventrale midthjerne-dopaminerge neuron progenitorer. Denne teknik kan anvendes til at opnå effektiv ekspression af gener af interesse at undersøge forskellige aspekter af midterhjerne udvikling og dopaminerg neuron differentiering.
Abstract
Dopaminerge neuroner beliggende i den ventrale midthjernen styrer bevægelser, følelsesmæssig adfærd og belønning mekanismer 1-3. Dysfunktion af ventrale midthjerne-dopaminerge neuroner er involveret i Parkinsons sygdom, skizofreni, depression og demens 1-5. Således kunne studere reguleringen af midthjernen dopaminerg neuron differentiering ikke kun give vigtig indsigt i mekanismer, der regulerer midthjernen udvikling og neurale stamceller skæbne specifikation, men også hjælpe med at udvikle nye terapeutiske strategier for behandling af forskellige mennesker neurologiske lidelser.
Dopaminerge neuroner skelne fra neurale stamceller, der beklæder ventrikulære zone af embryonisk ventral midthjernen. Udviklingen af neurale stamceller er styret af genekspression programmer 6,7. Her rapporterer vi teknikker anvender elektroporation til at udtrykke gener specifikt i midthjernen af Hamburger Hamilton (HH) scene 11 (thirteen somitter, 42 timer) kyllingeembryoer 8,9. Den eksterne Udviklingen af kyllingeembryoer giver mulighed for bekvem eksperimentelle manipulationer på specifikke fosterstadiet, med de følgevirkninger afgøres på et senere udviklingsmæssige tidspunkter 10-13. Chick embryoniske neurale rør tidligere end HH trin 13 (nitten somitter, 48 timer) består af multipotente neurale stamceller som er i stand til at differentiere til forskellige celletyper i nervesystemet. Den pCAG vektor, som indeholder både en CMV-promotor og en kylling β-actin-enhancer, tillader robust ekspression af Flag-eller andre epitop-mærkede konstruktioner i embryoniske kyllinge neurale rør 14. I denne rapport, lægger vi vægt på særlige foranstaltninger for at opnå regionalt begrænset genekspression i embryonale midterhjernedopaminerge dopaminerge neuron stamceller, herunder hvordan at injicere DNA-konstruktionerne specifikt til den embryonale midthjernen regionen og hvordan man kan lokalisere elektroporation med små skræddersyede elektroder. Analyse cHick midthjernen på senere stadier tilvejebringer et fremragende in vivo for plasmidvektoren-medieret gain-af-funktion og tab af funktion undersøgelser af midterhjernen udvikling. Modifikation af det eksperimentelle system kan strække assayet til andre dele af nervesystemet til udførelse skæbne kortlægningsanalyse og til undersøgelse af reguleringen af genekspression.
Protocol
Discussion
In ovo elektroporering af embryoniske kylling midthjernen giver en billig og hurtig alternativ til generering af transgene eller knockout-dyr at udføre in vivo undersøgelse af genfunktioner i midthjerne-dopaminerge neuron udvikling. Ved hjælp af korte 2 mm lange L-formet platinelektroder med embryoniske midthjernen-specifikt DNA-injektion er nøglen til at opnå effektiv ekspression af genet af interesse i midthjerne-dopaminerge neuron progenitorer. Hertil kommer, er ved hjælp af korrekte HH Etape …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi takker Dr. Takahiko Matsuda til tilvejebringelse af pCAG-mCherry konstruktion. YCM understøttes af en karriereudvikling Award fra Schweppe Foundation og en bevilling fra Whitehall Foundation.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue Number | Comments |
| Fertilized chicken eggs | Charles River Laboratories | ||
| Egg incubator | GQF Manufacturing | 1502 Sportsman | |
| BTX Electroporator | BTX Harvard Apparatus | ECM830 | |
| Electrodes | BTX Harvard Apparatus | 45-0162 L-shaped genetrodes | For use with ECM830 electroporator |
| Platinum iridium wire | Alfa Aesar | #10056 | 0.5 mm diameter For making the 2 mm long electrodes |
| Glass capillary tube | World Precision Instrument | TW100F-4 | |
| Microloader pipette tip | Eppendorf | 5242 956.003 | |
| India ink | Staples | Filter 20% before use | |
| Microinjector | Parker Automation, Parker Hannifin Cooperation |
Picospritzer III | |
| Fluorescent dissection microscope | Leica | MZ16F | |
| Micropipette puller | Sutter Instrument | D-97 |
References
- Wightman, R. M., Robinson, D. L. Transient changes in mesolimbic dopamine and their association with ‘reward’. J. Neurochem. 82, 721-735 (2002).
- Kelley, A. E., Berridge, K. C. The neuroscience of natural rewards: relevance to addictive drugs. J. Neurosci. 22, 3306-3311 (2002).
- Moore, D. J., West, A. B., Dawson, V. L., Dawson, T. M. Molecular pathophysiology of Parkinson’s disease. Annu. Rev. Neurosci. 28, 57-87 (2005).
- Dailly, E., Chenu, F., Renard, C. E., Bourin, M. Dopamine, depression and antidepressants. Fundam. Clin. Pharmacol. 18, 601-607 (2004).
- Sesack, S. R., Carr, D. B. Selective prefrontal cortex inputs to dopamine cells: implications for schizophrenia. Physiol. Behav. 77, 513-517 (2002).
- Ang, S. L. Transcriptional control of midbrain dopaminergic neuron development. Development. 133, 3499-3506 (2006).
- Andersson, E. Identification of intrinsic determinants of midbrain dopamine neurons. Cell. 124, 393-405 (2006).
- Hamburger, V., Hamilton, H. L. A Series of Normal Stages in the Development of the Chick Embryo. J. Morphol. 88, 49 (1951).
- Bellairs, R., Osmond, M. . The atlas of chick development. , (2005).
- Itasaki, N., Bel-Vialar, S., Krumlauf, R. ‘Shocking’ developments in chick embryology: electroporation and in ovo gene expression. Nat. Cell Biol. 1, 203-207 (1999).
- Momose, T. Efficient targeting of gene expression in chick embryos by microelectroporation. Dev. Growth Differ. 41, 335-344 (1999).
- Muramatsu, T., Mizutani, Y., Ohmori, Y., Okumura, J. Comparison of three nonviral transfection methods for foreign gene expression in early chicken embryos in ovo. Biochem. Biophys. Res. Commun. 230, 376-380 (1997).
- Nishi, T. High-efficiency in vivo gene transfer using intraarterial plasmid DNA injection following in vivo electroporation. Cancer Res. 56, 1050-1055 (1996).
- Matsuda, T., Cepko, C. L. Electroporation and RNA interference in the rodent retina in vivo and in vitro. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101, 16-22 (2004).
- Blank, M. C., Chizhikov, V., Millen, K. J. In Ovo Electroporations of HH Stage 10 Chicken Embryos. J. Vis. Exp. (9), e408 (2007).
- Chesnutt, C., Niswander, L. Plasmid-based short-hairpin RNA interference in the chicken embryo. Genesis. 39, 73-78 (2004).
