Na eletroporação in ovo em Midbrain pintainho para estudar a função do gene em dopaminérgico Desenvolvimento Neuron
Summary
Para avaliar a função e regulação de genes durante o desenvolvimento de neurónios dopaminérgicos do mesencéfalo, nós descrevemos um método que envolve<em> In ovo</em> Electroporação de construções de DNA de plasmídeo em embrionárias de bico ventral do mesencéfalo progenitores de neurónios dopaminérgicos. Esta técnica pode ser utilizada para conseguir a expressão eficiente de genes de interesse para estudar diferentes aspectos do desenvolvimento mesencéfalo e diferenciação neuronal dopaminérgico.
Abstract
Neurônios dopaminérgicos localizados no mesencéfalo ventral controle movimento, o comportamento emocional, e mecanismos de recompensa 1-3. A disfunção de ventral mesencéfalo dopaminérgica neurónios está implicado na doença de Parkinson, esquizofrenia, depressão, demência e 1-5. Assim, estudando a regulação da diferenciação de neurônios dopaminérgicos no mesencéfalo poderia não apenas fornecer informação importante sobre mecanismos de regulação do desenvolvimento de mesencéfalo e especificação destino neural progenitor, mas também ajudar a desenvolver novas estratégias terapêuticas para o tratamento de uma variedade de distúrbios neurológicos humanos.
Neurônios dopaminérgicos diferenciar dos progenitores neurais que revestem a zona ventricular de mesencéfalo ventral do embrião. O desenvolvimento de células progenitoras neurais é controlada por programas de expressão génica 6,7. Aqui relatamos técnicas utilizando eletroporação para expressar genes especificamente no mesencéfalo de estágio Hamburger Hamilton (HH) 11 (thsomitos irteen, 42 horas) embriões de galinha 8,9. O desenvolvimento externo de embriões de galinha permite convenientes manipulações experimentais específicas em estágios embrionários, com os efeitos determinados em momentos posteriores de desenvolvimento 10-13. Tubos pintainho embrionárias neurais mais cedo do que HH fase 13 (dezanove sómitos, 48 horas) consistem em multipotentes progenitores neurais que são capazes de se diferenciar em tipos de células distintas do sistema nervoso. O vector pCAG, que contém tanto um promotor de CMV e um pintainho β-actina potenciador, permite a expressão robusta de Flag ou outras construções de epítopo-etiquetados em tubos de bico embrionárias neurais 14. Neste relatório, destacamos medidas especiais para alcançar a expressão do gene regionalmente restrito em embrionárias mesencéfalo progenitores de neurônios dopaminérgicos, incluindo a forma de injectar DNA constrói especificamente para a região do mesencéfalo embrionário e como identificar eletroporação com pequenos feitos por eletrodos. Analisando cmesencéfalo caipira em fases posteriores proporciona um excelente sistema in vivo para plasmídeo vetor mediada por ganho de função e perda de função de estudos de desenvolvimento mesencéfalo. Modificação do sistema experimental pode prolongar o ensaio para outras partes do sistema nervoso para executar a análise de mapeamento de destino e para investigar a regulação da expressão do gene.
Protocol
Discussion
A eletroporação em ovo de pinto mesencéfalo embrionário oferece um baixo custo e rápida alternativa para a geração de animais transgênicos ou knockout para realizar estudo in vivo de funções de genes no mesencéfalo de desenvolvimento neurônio dopaminérgico. Usando 2 mm curto eléctrodos de platina longos em forma de L, juntamente com a injecção de DNA embrionário mesencéfalo-específica é a chave para alcançar expressão eficiente do gene de interesse em progenitores do mese…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos ao Dr. Takahiko Matsuda para fornecer o pCAG-mCherry construir. YCM é suportado por um prêmio de Desenvolvimento de Carreira da Fundação Schweppe e uma bolsa da Fundação Whitehall.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue Number | Comments |
| Fertilized chicken eggs | Charles River Laboratories | ||
| Egg incubator | GQF Manufacturing | 1502 Sportsman | |
| BTX Electroporator | BTX Harvard Apparatus | ECM830 | |
| Electrodes | BTX Harvard Apparatus | 45-0162 L-shaped genetrodes | For use with ECM830 electroporator |
| Platinum iridium wire | Alfa Aesar | #10056 | 0.5 mm diameter For making the 2 mm long electrodes |
| Glass capillary tube | World Precision Instrument | TW100F-4 | |
| Microloader pipette tip | Eppendorf | 5242 956.003 | |
| India ink | Staples | Filter 20% before use | |
| Microinjector | Parker Automation, Parker Hannifin Cooperation |
Picospritzer III | |
| Fluorescent dissection microscope | Leica | MZ16F | |
| Micropipette puller | Sutter Instrument | D-97 |
References
- Wightman, R. M., Robinson, D. L. Transient changes in mesolimbic dopamine and their association with ‘reward’. J. Neurochem. 82, 721-735 (2002).
- Kelley, A. E., Berridge, K. C. The neuroscience of natural rewards: relevance to addictive drugs. J. Neurosci. 22, 3306-3311 (2002).
- Moore, D. J., West, A. B., Dawson, V. L., Dawson, T. M. Molecular pathophysiology of Parkinson’s disease. Annu. Rev. Neurosci. 28, 57-87 (2005).
- Dailly, E., Chenu, F., Renard, C. E., Bourin, M. Dopamine, depression and antidepressants. Fundam. Clin. Pharmacol. 18, 601-607 (2004).
- Sesack, S. R., Carr, D. B. Selective prefrontal cortex inputs to dopamine cells: implications for schizophrenia. Physiol. Behav. 77, 513-517 (2002).
- Ang, S. L. Transcriptional control of midbrain dopaminergic neuron development. Development. 133, 3499-3506 (2006).
- Andersson, E. Identification of intrinsic determinants of midbrain dopamine neurons. Cell. 124, 393-405 (2006).
- Hamburger, V., Hamilton, H. L. A Series of Normal Stages in the Development of the Chick Embryo. J. Morphol. 88, 49 (1951).
- Bellairs, R., Osmond, M. . The atlas of chick development. , (2005).
- Itasaki, N., Bel-Vialar, S., Krumlauf, R. ‘Shocking’ developments in chick embryology: electroporation and in ovo gene expression. Nat. Cell Biol. 1, 203-207 (1999).
- Momose, T. Efficient targeting of gene expression in chick embryos by microelectroporation. Dev. Growth Differ. 41, 335-344 (1999).
- Muramatsu, T., Mizutani, Y., Ohmori, Y., Okumura, J. Comparison of three nonviral transfection methods for foreign gene expression in early chicken embryos in ovo. Biochem. Biophys. Res. Commun. 230, 376-380 (1997).
- Nishi, T. High-efficiency in vivo gene transfer using intraarterial plasmid DNA injection following in vivo electroporation. Cancer Res. 56, 1050-1055 (1996).
- Matsuda, T., Cepko, C. L. Electroporation and RNA interference in the rodent retina in vivo and in vitro. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101, 16-22 (2004).
- Blank, M. C., Chizhikov, V., Millen, K. J. In Ovo Electroporations of HH Stage 10 Chicken Embryos. J. Vis. Exp. (9), e408 (2007).
- Chesnutt, C., Niswander, L. Plasmid-based short-hairpin RNA interference in the chicken embryo. Genesis. 39, 73-78 (2004).
