Básico<em> Caenorhabditis elegans</em> Métodos: Sincronização e observação

Summary

A facilidade de manutenção e propagação do nemátodo<em> C. elegans</em> Torná-lo um organismo modelo agradável para trabalhar. A possibilidade de vermes sincronização permite que o trabalho com uma quantidade significativa de sujeitos na mesma fase de desenvolvimento, o que facilita o estudo de um processo particular em muitos animais.

Abstract

A investigação sobre a biologia molecular e do desenvolvimento de Caenorhabditis elegans nematóides foi iniciada na década de setenta por Sydney Brenner e desde então tem sido amplamente utilizado como um organismo modelo ^1. C. elegans possui atributos-chave, tais como a transparência, simplicidade e ciclo de vida curto que o tornaram um sistema experimental para estudos biológicos fundamentais para vários anos ^2. Descobertas neste nematóide tem amplas implicações, pois muitos processos celulares e moleculares que o desenvolvimento animal controle evolutivo são ³ conservada.

C. elegans ciclo de vida passa por uma fase embrionária e quatro estágios larvais antes de os animais atingirem a idade adulta. Desenvolvimento pode levar de 2 a 4 dias, dependendo da temperatura. Em cada uma das várias fases traços característicos podem ser observadas. O conhecimento da sua linhagem celular completa ^4,5, juntamente com o annotat profundaíon de seu genoma transformar este nematóide em um grande modelo em domínios tão diversos como a neurobiologia, ^{6 de} envelhecimento ^7,8, biologia das células estaminais ⁹ e biologia germinal ^10.

Uma característica adicional que faz com que C. elegans um modelo atraente para trabalhar com a possibilidade de obtenção de populações de vermes sincronizados a uma fase específica através de um protocolo relativamente fácil. A facilidade de manutenção e propagação deste nemátodo adicionado à possibilidade de sincronização proporcionar uma ferramenta poderosa para obter grandes quantidades de vermes, que podem ser utilizados para uma grande variedade de pequenas experiências ou de alto rendimento como telas de RNAi, microarrays, sequenciação maciço, immunoblot ou hibridação in situ, entre outros.

Devido à sua transparência, C. elegans estruturas podem ser distinguidos sob o microscópio usando microscopia de contraste de interferência diferencial, também conhecido como Nomarski microscopiar. A utilização de um ligante de ADN fluorescente, DAPI (4 ',6-diamidino-2-fenilindol), por exemplo, pode levar à identificação e localização específica de células individuais, bem como as estruturas subcelulares / defeitos associados aos mesmos.

Protocol

1. Protocolo A: Worms cultivo de Branqueamento 11 Grandes populações de C. elegans pode ser obtido através da cultura de los quer em meios líquidos ou em suportes sólidos em placas. Eles são geralmente cultivadas em NGM sólido (meios de crescimento dos nemátodos) e alimentados com E. bactérias coli, que é adicionado para as placas, ou vivos ou mortos (morto por UV 12, pelo calor 13 ou pelo frio 14). O procedimento…

Discussion

Sincronização de nematóide

Várias soluções de branqueamento têm sido descritos. Tentámos cinco receitas diferentes (Tabela I) e, nas nossas mãos, eles não mostraram diferenças significativas na sincronização de populações de vermes (Fig. 1). No entanto, as nossas experiências fez mostram que os parâmetros como a temperatura (Fig. 2), a solução rácio de branqueamento: volume de vermes (Fig. 3) e do volume de …