Grundlæggende<em> Caenorhabditis elegans</em> Metoder: Synkronisering og Observation

Summary

Den lethed at bevare og udbrede nematode<em> C. elegans</em> Gør det til en dejlig model organisme at arbejde med. Muligheden for at synkronisere orme tillader arbejde med en betydelig mængde af emner på samme udviklingstrin, hvilken letter undersøgelsen af ​​en bestemt proces med mange dyr.

Abstract

Forskning i molekylær-og udviklingsmæssige biologi nematode Caenorhabditis elegans blev påbegyndt i begyndelsen af halvfjerdserne af Sydney Brenner, og det er siden blevet brugt i udstrakt grad som en model organisme ^1. C. elegans besidder vigtige egenskaber, såsom enkelhed, gennemsigtighed og kort livscyklus, der har gjort det til et egnet eksperimentelle system til grundlæggende biologiske undersøgelser i mange år ^2. Fund i denne nematode have bred betydning, fordi mange cellulære og molekylære processer, der styrer dyret udvikling er evolutionære bevarede ^3.

C. elegans livscyklus går gennem en fosterstadiet og fire larvestadier, før dyrene når voksenalderen. Udviklingen kan tage fra 2 til 4 dage, afhængigt af temperaturen. I hvert af trinnene flere karakteristiske træk kan observeres. Den viden om sin fuldstændige celleafstamning ^4,5 sammen med den dybe annotation af sit genom gøre denne nematode til en stor model i så forskellige områder som neurobiologi ^6, aldring ^7,8, stamcellebiologi ⁹ og kønscellerne biologi ^10.

En yderligere funktion, der gør C. elegans en attraktiv model til at arbejde med, er muligheden for at opnå populationer af orme synkroniseret på et bestemt trin i en forholdsvis let protokol. Den lette vedligeholdelse og udbrede denne nematode tilsat til muligheden for synkroniseringen et virkningsfuldt værktøj til at opnå store mængder af orme, der kan anvendes til en lang række af små eller high-throughput eksperimenter såsom RNAi skærme, microarrays, massiv sekventering, immunblot eller in situ hybridisering, blandt andre.

På grund af sin åbenhed, C. elegans strukturer kan skelnes under mikroskop ved anvendelse af differentiel interferenskontrast-mikroskopi, også kendt som Nomarski MICROSkopiere. Anvendelsen af ​​et fluorescerende DNA bindemiddel, DAPI (4 ',6-diamidino-2-phenylindol), for eksempel, kan føre til specifik identifikation og lokalisering af individuelle celler, såvel som subcellulære strukturer og mangler forbundet med dem.

Protocol

1. Protokol A: Dyrkning af Worms til blegning 11 Store populationer af C. elegans kan opnås ved dyrkning deraf i enten flydende medier eller på faste medier i pladerne. De er sædvanligvis dyrket på fast NGM (nematodevækst medier) og fodret med E. coli-bakterier, der tilsættes til pladerne enten levende eller døde (dræbt ved UV 12, ved hjælp af varme 13 eller kold 14). Den mest almindelige procedure bruger levende OP50 E…

Discussion

Nematode Synkronisering

Adskillige blegende opløsninger er blevet beskrevet. Vi prøvede fem forskellige opskrifter (tabel I), og i vores hænder, har de ikke udviser betydelige forskelle i synkroniseringen af snekkegear populationer (fig. 1). Imidlertid vore eksperimenter viste, at parametre, såsom temperatur (fig. 2), idet forholdet blegningsopløsningen: volumen orme (fig. 3), og mængden af M9 som embryonerne inkuberes ud…