Affinitetsrening av ribonukleoprotein influensavirus komplex från kromatinet hos infekterade celler
Summary
Influensavirus replikera sitt RNA-genom i association med värd-cell-kromatin. Här presenterar vi en metod för att rena intakta virala ribonukleoproteinpartiklar komplex från kromatin av infekterade celler. Renat virus komplex kan analyseras genom både Western blöt och primerförlängning av protein och RNA-halt, respektive.
Abstract
Liksom alla negativ-strängade RNA-virus, är i genomet hos influensavirus förpackas i form av virala ribonukleoproteinpartiklar komplex (vRNP), i vilka den enkelsträngade genomet är inkapslade av nukleoprotein (NP) och associerad med den trimera polymeras komplex bestående av PA, PB1, och PB2 subenheter. Emellertid, i motsats till de flesta RNA-virus, influensavirus utföra virala RNA-syntes i kärnan av infekterade celler. Intressant nog använder virala mRNA-syntes cellulära pre-mRNA som primers, och det har föreslagits att denna process äger rum på kromatin 1. Interaktioner mellan virala polymeraset och värd-RNA-polymeras II, såväl som mellan nonylfenol och nukleosomer värdceller har också karaktäriserats 1,2.
Nyligen framtagandet av rekombinanta influensavirus som kodar en En-strep-markör fuserad genetiskt till C-terminalen av den PB2-subenheten av det virala polymeraset (rWSN-PB2-Strep 3) har blisv beskrivits. Dessa rekombinanta virus tillåta reningen av PB2-innehållande komplex, inklusive vRNPs, från infekterade celler. För att erhålla renat vRNPs är cellkulturer infekterades, och vRNPs är affinitetsrenades från lysat härrörande från dessa celler. Har dock lys förfaranden som används hittills varit baserad på en steg tvättmedel lys, som trots närvaron av en allmän nukleas, ofta extrahera kromatin-bundna materialet enbart ineffektivt.
Våra preliminära arbete föreslog att en stor del av nukleära vRNPs inte extraherades under traditionella cellys, och kunde därför inte vara affinitetsrenade. För att öka denna extraktion effektivitet och för att separera kromatin-bundet från icke-kromatin-bundna kärnvapen vRNPs, anpassade vi en stegvis subcellulär utvinning protokoll till influensa virus-infekterade celler. Kortfattat separerar detta förfarande först kärnorna från cellen och därefter extraherar lösliga nukleära proteiner (här benämnd "nucleoplasmic" fraktion).Den återstående olösliga kärnmaterial digereras sedan med Benzonase, en ospecifik DNA / RNA-nukleas, följt av två steg saltextraktion: först med användning av 150 mM NaCl (benämnd "CH150"), sedan 500 mM NaCl ("ch500") (fig 1 ). Dessa salt extraktionssteg valdes baserat på vår iakttagelse att 500 mM NaCl var tillräcklig för att solubilisera över 85% av kärn-vRNPs ändå medge bindning av märkta vRNPs till affinitetsmatrisen.
Efter subcellulär fraktionering av infekterade celler, är det möjligt att affinitetsrena PB2-märkta vRNPs från varje individuell fraktion och analysera deras protein-och RNA-komponenter med Western blöt och primerförlängning, respektive. Nyligen utnyttjade vi denna metod för att upptäcka att vRNP export komplex form under slutet av poäng efter infektion på kromatinet fraktionen extraheras med 500 mM NaCl (ch500) 3.
Protocol
Discussion
Medan många studier har nyligen identifierat enskilda proteiner eller cellulära nätverk som deltar i influensavirusinfektion 8 förblir den funktionella betydelsen av de flesta av dessa interaktioner oklar. Med tanke på absolut beroende av kromatin-baserade funktioner för influensa-virus-RNA-syntes och komplexet biofysiska och biokemiska natur kärnan 9, kommer nya tekniker krävas för att belysa dessa funktioner. Den subnuclear fraktionering vi presenterar här, tillsammans med affinitet ren…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Författarna vill tacka Nada Naffakh och Marie-Anne Rameix-Welti (Institut Pasteur) för rWSN-PB2-Strep virus.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
| DMEM-high glucose | Gibco | 11965-092 | |
| BSA | Sigma | A9418 | |
| Protease inhibitor Mix G | Serva | 39101 | |
| Benzonase Nuclease | Novagen | 71206 | 25 U/μl |
| DNase I, RNase-free | ThermoScientific | EN0523 | 50 U/μl |
| Dounce homogenizer | Wheaton | 432-1271 | Use type “B” pestle |
| Strep-Tactin Sepharose | IBA GmbH | 2-1201-025 | 50% suspension column format can also be used |
| Desthiobiotin | IBA GmbH | 2-1000-002 |
References
- Engelhardt, O. G., Smith, M., Fodor, E. Association of the influenza A virus RNA-dependent RNA polymerase with cellular RNA polymerase II. J. Virol. 79, 5812-5812 (2005).
- Garcia-Robles, I., Akarsu, H., Müller, C. W., Ruigrok, R., Baudin, F. Interaction of influenza virus proteins with nucleosomes. Virology. 332, 329 (2005).
- Chase, G. P., Rameix-Welti, M. A., Zvirbilene, A., Zvirblis, G., Götz, V., Wolff, T., Naffakh, N., Schwemmle, M. Influenza virus ribonucleoprotein complexes gain preferential access to cellular export machinery through chromatin targeting. PLoS Pathogens. 7, e1002187 (2011).
- Kimura, H., Tao, Y., Roeder, R. G., Cook, P. R. Quantitation of RNA polymerase II and its transcription factors in an HeLa cell: little soluble holoenzyme but significant amounts of polymerases attached to the nuclear substructure. Mol. Cell. Biol. 19, 5383-5383 (1999).
- Henikoff, S., Henikoff, J. G., Sakai, A., Loeb, G. B., Ahmad, K. Genome-wide profiling of salt fractions maps physical properties of chromatin. Genome Res. 19, 460 (2009).
- Rodriguez, A., Perez-Gonzalez, A., Nieto, A. Influenza virus infection causes specific degradation of the largest subunit of cellular RNA polymerase II. J. Virol. 81, 5315-5315 (2007).
- Ye, Z., Liu, T., Offringa, D. P., McInnis, J., Levandowski, R. A. Association of influenza virus matrix protein with ribonucleoproteins. J. Virol. 73, 7467-7467 (1999).
- Watanabe, T., Watanabe, S., Kawaoka, T., Y, . Cellular networks involved in the influenza virus life cycle. Cell Host Microbe. 7, 427 (2010).
- Engelhardt, O. G., Fodor, E. Functional association between viral and cellular transcription during influenza virus infection. Rev. Med. Virol. 16, 329-345 (2006).
- Schwartz, L. B., Sklar, V. E., Jaehning, J. A., Weinmann, R., Roeder, R. G. Isolation and partial characterization of the multiple forms of deoxyribonucleic acid-dependent ribonucleic acid polymerase in the mouse myeloma, MOPC 315. J. Biol. Chem. 249, 5889 (1974).
- Lambert, J. P., Baetz, K., Figeys, D. Of proteins and DNA–proteomic role in the field of chromatin research. Mol. Biosyst. 6, 30 (2010).
- Wu, C. Y., Jeng, K. S., Lai, M. M. The SUMOylation of matrix protein M1 modulates the assembly and morphogenesis of influenza A virus. J. Virol. 85, 6618 (2011).
- Liao, T. L., Wu, C. Y., Su, W. C., Jeng, K. S., Lai, M. M. Ubiquitination and deubiquitination of NP protein regulates influenza A virus RNA replication. EMBO J. 29, 3879 (2010).
