감염된 세포의 염색질에서 인플루엔자 바이러스 Ribonucleoprotein 컴플렉스의 동질 정제
Summary
인플루엔자 바이러스는 호스트 세포 염색질과 협회들의 RNA 게놈을 복제. 여기서는 감염된 세포의 염색질에서 그대로 바이러스성 ribonucleoprotein 컴플렉스를 정화하는 방법을 제시한다. 바이러스 단지 투석을하는 것은 각각 서양 얼룩 및 단백질과 RNA 내용의 프라이머 확장명을 모두에 의해 분석할 수 있습니다.
Abstract
모든 부정적인 – 가닥 RNA 바이러스와 마찬가지로 인플루엔자 바이러스의 게놈은 단일 좌초된 게놈은 핵 단백질 (NP)에 의해 encapsidated, 그리고 구성된 trimeric 효소 복합과 연관된되는 바이러스성 ribonucleoprotein 컴플렉스 (vRNP)의 형태로 패키지되어 PA, PB1, 그리고 PB2 subunits의. 그러나 대부분의 RNA 바이러스와는 달리, 인플루엔자 바이러스는 감염된 세포의 핵에 바이러스 RNA 합성을 수행합니다. 흥미롭게도, 바이러스성 mRNA 합성이 primers로 세포 사전 mRNAs를 사용하고,이 과정은 염색질 1 이루어지는 것이 제안되었습니다. 바이러스 중합 효소와 RNA 중합 효소 II 호스트뿐만 아니라, NP 및 호스트 nucleosomes 간의 상호 작용은 또한 1,2를 묘사하고있다.
최근 원 – Strep-태그를 인코딩 재조합 독감 바이러스의 세대 유전자가 바이러스 중합 효소의 PB2 subunit의 C-말단 (rWSN-PB2-Strep 3)로했습니다 융합실내는 설명했다. 이러한 재조합 바이러스가 감염된 세포에서 vRNPs 포함한 PB2 함유 단지,의 정화를 허용합니다. vRNPs 투석을 받기 위해서는, 세포 배양은 감염 및 vRNPs이 세포에서 파생된 lysates에서 정화 친화력 있습니다. 그러나 탁아소를 운영하는 용해 절차는 일반 nuclease의 존재에도 불구하고, 주로 inefficiently 염색질 바인딩된 자료를 추출 한 단계 세제 용해에 기반하고있다.
우리의 예비 작업은 핵 vRNPs의 많은 부분은 전통적인 세포 용해 동안 추출되지 않은 것을 제안, 따라서 친화력 정화 될 수 없었습니다. 이 추출 효율을 향상시키기 위해, 비 염색질 바인딩된 핵 vRNPs에서 염색질 표지인 분리, 우리는 인플루엔자 바이러스에 감염된 세포 단계 현명한 subcellular 추출 프로토콜을 적응. 간단히,이 절차는 먼저 세포에서 핵을 분리하고 용해 핵 단백질 (여기서 "nucleoplasmic"분수 되나) 추출합니다.남은 불용성 핵 자료는 다음 Benzonase, 두 소금 추출 단계 뒤에 unspecific의 DNA / RNA nuclease로 소화된다 : 먼저 150 MM NaCl (이하 "ch150 '되나)를 사용하여 다음 500 MM NaCl ("ch500 ") (그림 1 ). 이러한 소금 추출 단계 500 밀리미터 NaCl 아직 여전히 친화 행렬에 태그를 vRNPs의 바인딩을 허용 핵 vRNPs의 85 % 이상 solubilize하기에 충분하다고 우리의 관찰을 바탕으로 선정되었습니다.
감염된 세포의 subcellular 분별화 후, 그것은 각각의 분획의 친화력 정화 PB2-태그를 vRNPs하는 것이 가능하고 단백질과 각각 서양 얼룩 및 프라이머 확장자를 사용하여 RNA 구성 요소를 분석합니다. 최근, 우리는 500 MM NaCl (ch500) 3 추출한 염색질 분획에서 감염 후 늦은 점 중 그 vRNP 수출 단지 양식을 발견하는이 방법을 활용.
Protocol
Discussion
많은 연구가 최근에 각각의 단백질이나 인플루엔자 바이러스 감염 8 개입 셀룰러 네트워크를 확인하고 있지만, 이러한 상호 작용의 대부분의 기능 의미는 불분명 남아 있습니다. 독감 바이러스는 RNA 합성과 핵 9 복잡 biophysical 및 생화 학적 자연을위한 염색질 기반 기능의 절대적인 의존성을 감안할 때, 새로운 기술은 이러한 기능을 명료하게하다하셔야합니다. vRNPs의 친화력 정화…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
저자 rWSN-PB2-Strep 바이러스 나다 Naffakh과 마리 앤 Rameix-Welti (Institut 파스퇴르)을 감사드립니다.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
| DMEM-high glucose | Gibco | 11965-092 | |
| BSA | Sigma | A9418 | |
| Protease inhibitor Mix G | Serva | 39101 | |
| Benzonase Nuclease | Novagen | 71206 | 25 U/μl |
| DNase I, RNase-free | ThermoScientific | EN0523 | 50 U/μl |
| Dounce homogenizer | Wheaton | 432-1271 | Use type “B” pestle |
| Strep-Tactin Sepharose | IBA GmbH | 2-1201-025 | 50% suspension column format can also be used |
| Desthiobiotin | IBA GmbH | 2-1000-002 |
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