Influensavirus kopiere deres RNA genomet i forbindelse med host-celle kromatin. Her presenterer vi en metode for å rense intakte viral ribonucleoprotein komplekser fra kromatin av infiserte celler. Renset virale komplekser kan analyseres av både Western blot og primer forlengelse av protein og RNA innhold, henholdsvis.
Som alle negative-Strand RNA virus, er genomet til influensavirus pakket i form av viral ribonucleoprotein komplekser (vRNP), der single-strandet genomet er encapsidated av nucleoprotein (NP), og tilknyttet trimeric polymerase som består av PA, PB1, og PB2 underenhetene. Men i motsetning til de fleste RNA virus, influensavirus utføre viral RNA syntese i kjernen av infiserte celler. Interessant, bruker viral mRNA-syntese cellulære pre-mRNA som primere, og det har blitt foreslått at denne prosessen foregår på kromatin en. Interaksjoner mellom viral polymerase og verten RNA polymerase II, samt mellom NP og vert nucleosomes har også blitt karakterisert 1,2.
Nylig, generering av rekombinante influensavirus som koder en One-Strep-Tag genetisk smeltet til C-terminus av PB2 subenhet av viral polymerase (rWSN-PB2-Strep 3) har væreEN beskrevet. Disse rekombinante virus tillate rensing av PB2-holdige komplekser, inkludert vRNPs, fra infiserte celler. For å oppnå renset vRNPs, blir cellekulturer smittet, og vRNPs er affinitet renset fra lysates avledet fra disse cellene. Imidlertid har de lysis prosedyrer som brukes hittil vært basert på ett-trinns vaskemiddel lysis, som, til tross for tilstedeværelsen av en generell nuklease, ofte trekke kromatin-bundet materiale bare ineffektivt.
Vårt forarbeidet antydet at en stor del av kjernefysiske vRNPs ikke ble trukket under tradisjonell cellelyse, og derfor ikke kunne være slektskap renset. For å øke denne utvinning effektivitet, og å skille kromatin-bundet fra ikke-kromatin-bundet kjernefysiske vRNPs, tilpasset vi en trinnvis subcellulære utvinning protokollen til influensa virus-infiserte celler. Kort, skiller denne prosedyren første kjernene fra cellen og deretter trekker oppløselige kjernefysiske proteiner (her kalt "nucleoplasmic" fraksjon).De resterende uløselige kjernefysisk materiale blir så fordøyd med Benzonase, en uspesifikk DNA / RNA nuklease, etterfulgt av to salt ekstraksjonsmetoder trinn: først med 150 mM NaCl (kalt "ch150"), deretter 500 mM NaCl ("ch500") (Fig. 1 ). Disse salt ekstraksjonsmetoder trinnene ble valgt basert på observasjon vår at 500 mM NaCl var tilstrekkelig til å solubilize over 85% av kjernefysiske vRNPs likevel tillate binding av kodede vRNPs til affinitet matrisen.
Etter subcellulære fraksjonering av infiserte celler, er det mulig å affinitet rense PB2-merket vRNPs fra hver enkelt fraksjon og analysere deres protein og RNA komponenter ved hjelp av Western Blot og primer extension, henholdsvis. Nylig, benyttet vi denne metoden for å oppdage at vRNP eksport komplekser skjemaet under slutten poeng etter infeksjon på kromatin brøkdel ekstrahert med 500 mM NaCl (ch500) 3.
Mens mange studier har nylig identifisert enkelte proteiner eller mobilnett involvert i influensavirusinfeksjon 8, forblir den funksjonelle betydningen av de fleste av disse interaksjonene uklar. Gitt den absolutte avhengighet av kromatin-baserte funksjoner for influensavirus RNA syntese og komplekse biofysiske og biokjemiske natur kjernen 9, vil nye teknikker bli pålagt å belyse disse funksjonene. Den subnuclear fraksjonering vi presenterer her, kombinert med affinitet rensing av vRNPs, tillater…
The authors have nothing to disclose.
Forfatterne ønsker å takke Nada Naffakh og Marie-Anne Rameix-Welti (Institut Pasteur) for rWSN-PB2-Strep virus.
Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
DMEM-high glucose | Gibco | 11965-092 | |
BSA | Sigma | A9418 | |
Protease inhibitor Mix G | Serva | 39101 | |
Benzonase Nuclease | Novagen | 71206 | 25 U/μl |
DNase I, RNase-free | ThermoScientific | EN0523 | 50 U/μl |
Dounce homogenizer | Wheaton | 432-1271 | Use type “B” pestle |
Strep-Tactin Sepharose | IBA GmbH | 2-1201-025 | 50% suspension column format can also be used |
Desthiobiotin | IBA GmbH | 2-1000-002 |