Produktion af lentivirusvektorer til transduktion af celler fra det centrale nervesystem
Summary
I denne protokol beskriver vi fremstilling, oprensning og titrering af lentivirale vektorer. Vi giver et eksempel lentivirale vektor-formidlet gen-levering i primære dyrkede neuroner og astrocytter. Vores metoder kan også gælde for andre celletyper<em> In vitro</em> Og<em> In vivo</em>.
Abstract
Effektiv gen-levering i centralnervesystemet (CNS) er vigtigt at studere genfunktioner, modellering neurologiske sygdomme og udvikle terapeutiske fremgangsmåder. Lentivirale vektorer er attraktive redskaber i transduktion af neuroner og andre celletyper i CNS, som de transducerer både delende og ikke-delende celler, støtte vedvarende ekspression af transgener og har relativt store emballager kapacitet og lav toksicitet 1-3. Lentivirale vektorer er blevet anvendt med held i transducerende mange neurale celletyper in vitro 4-6 og i dyr 7-10.
Store bestræbelser er blevet gjort på at udvikle lentivirale vektorer med forbedret biosikkerhed og effektivitet genafgivelse. De nuværende tredje generation replikationsdefekte og selv-inaktiverende (SIN) lentivirale vektorer er afbildet i figur 1.. De nødvendige elementer til vektor emballage er opdelt i fire plasmider. I lentivirale transfer plasmid er U3 regionen i 5 'lange terminale gentagelse (LTR) erstattet med en stærk promotor fra en anden virus. Denne modifikation tillader transkription af vektorsekvensen uafhængigt af HIV-1 Tat-protein, der normalt kræves for HIV-genekspression 11. Emballagen signal (Ψ) er afgørende for indkapsling og Rev-responsive element (RRE) er påkrævet til frembringelse af høj titer vektorer. Den centrale polypurin tarmkanalen (cPPT) er vigtig for kerneimport af vektor-DNA, en egenskab der kræves til at transducere ikke-delende celler 12. I 3'-LTR, er cis-regulatoriske sekvenser fjernes fuldstændigt fra U3 region. Denne deletion kopieres til 5 'LTR efter revers transkription, hvilket resulterer i transkriptionel inaktivering af begge LTR'er. Plasmid pMDLg / pRRE indeholder HIV-1 gag / pol gener, som giver strukturelle proteiner og revers transkriptase. pRSV-Rev koder Rev som binder til RRE til effektiv RNA eksport fra kernen. pCMV-G koderdet vesikulære stomatitis virus glycoprotein (VSV-G), der erstatter HIV-1-env. VSV-G udvider tropisme af vektorerne og tillader koncentration via ultracentrifugering 13. Alle de gener, der koder de accessoriske proteiner, herunder vif, vpr, vpu og Nef er udelukket i emballagen systemet. Produktion og manipulation af lentivirale vektorer skal udføres i overensstemmelse med NIH retningslinjer for forskning, der involverer rekombinant DNA ( http://oba.od.nih.gov/oba/rac/Guidelines/NIH_Guidelines.pdf ). En godkendelse fra de enkelte institutioners biologiske og kemiske Sikkerhedsudvalget kan være påkrævet, før du bruger lentivirusvektorer. Lentivirale vektorer fremstilles almindeligvis ved cotransfektion af 293T-celler med lentiviral transferplasmidet og hjælpeviruset plasmider kodende for proteiner nødvendige for vektor emballage. Mange lentivirale transferplasmider og hjælper plasmider kan opnås fra Addgene en ikke-Profit plasmid arkiv ( http://www.addgene.org/~~V ). Nogle stabile pakkecellelinier er blevet udviklet, men disse systemer giver mindre fleksibilitet, og deres emballage effektivitet overordnet set falder over tid 14, 15. Kommercielt tilgængelige transfektion kits kan understøtte høje effektivitet af transfektion 16, men de kan være meget dyrt for store vektor-præparationer. Calciumphosphatpræcipitation metoder tilvejebringe højeffektive transfektion af 293T-celler og således tilvejebringe en pålidelig og omkostningseffektiv fremgangsmåde til lentiviral vektor-produktion.
I denne protokol, fremstiller vi lentivirusvektorer ved cotransfektion af 293T-celler med fire plasmider baseret på calciumphosphatpræcipitation princip, efterfulgt af oprensning og koncentrering med ultracentrifugering gennem en 20% saccharosepude. Vektoren titere bestemmes ved fluorescens-aktiveret cellesortering (FACS) Analysis eller ved realtid qPCR. Produktion og titrering af lentivirusvektorer i denne protokol kan afsluttes med 9 dage. Vi giver et eksempel på transducerende disse vektorer i murine neocorticale kulturer indeholdende både neuroner og astrocytter. Vi viser, at lentivirusvektorer understøtte høje effektivitet transduktion og celletype-specifik genekspression i primære dyrkede celler fra CNS.
Protocol
Discussion
I denne protokol, har vi vist, at produktionen af lentivirusvektorer og anvendelsen af disse vektorer i neocorticale kulturer. Vi demonstreret effektiv og celletype-specifik transduktion med vektorerne fremstillet ved disse fremgangsmåder. Når synapsin promotor anvendes, GFP-ekspression er strengt neuron specifik. Når GFAP promotor anvendes, GFP-ekspression udelukkende i astrocytter. Hvis der ikke celletype-specifik ekspression er nødvendig, kan en allestedsnærværende promoter anvendes. Fandt vi både …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbejde blev støttet af NIH Neuroscience handleplanen Core tilskud (P30 NS057105, BJS) til Washington University, Program Project Grant NS032636 (BJS) og af Hope Center for neurologiske lidelser.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number |
| DMEM | Sigma-Aldrich | D5796 |
| MEM | Invitrogen | 11090-081 |
| Fetal bovine serum | Hyclone | SV3001403 |
| PBS | Mediatech | 21-040-CM |
| Trypsin-EDTA | Sigma-Aldrich | T3924 |
| Sodium butyrate | Sigma-Aldrich | B5887 |
| Hexadimethrine bromide (Polybrene) | Sigma-Aldrich | H9268 |
| 293T cells | ATCC | CRL-11268 |
| HT1080 cells | ATCC | CCL-121 |
| Falcon 100 x 20 mm tissue culture dish | BD Biosciences | 353003 |
| 1 x 3 ½ in polyallomoer centrifuge tube | Beckman-Coulter | 326823 |
| 0.2-micron syringe filter | Corning | 431219 |
| QIAamp DNA Mini Kit | Qiagen | 51304 |
References
- Naldini, L. In vivo gene delivery and stable transduction of nondividing cells by a lentiviral vector. Science. 272, 263-267 (1996).
- Zufferey, R. Self-inactivating lentivirus vector for safe and efficient in vivo gene delivery. J. Virol. 72, 9873-9880 (1998).
- Davidson, B. L., Breakefield, X. O. Viral vectors for gene delivery to the nervous system. Nat. Rev. Neurosci. 4, 353-364 (2003).
- Gascon, S., Paez-Gomez, J. A., Diaz-Guerra, M., Scheiffele, P., Scholl, F. G. Dual-promoter lentiviral vectors for constitutive and regulated gene expression in neurons. J. Neurosci. Methods. 168, 104-1012 (2008).
- Hioki, H. Efficient gene transduction of neurons by lentivirus with enhanced neuron-specific promoters. Gene Ther. 14, 872-882 (2007).
- Li, M. Optimal promoter usage for lentiviral vector-mediated transduction of cultured central nervous system cells. J. Neurosci. Methods. 189, 56-64 (2010).
- Naldini, L., Blomer, U., Gage, F. H., Trono, D., Verma, I. M. Efficient transfer, integration, and sustained long-term expression of the transgene in adult rat brains injected with a lentiviral vector. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 93, 11382-11388 (1996).
- Blomer, U. Highly efficient and sustained gene transfer in adult neurons with a lentivirus vector. J. Virol. 71, 6641-6649 (1997).
- Consiglio, A. Robust in vivo gene transfer into adult mammalian neural stem cells by lentiviral vectors. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101, 14835-14840 (2004).
- Jakobsson, J., Ericson, C., Jansson, M., Bjork, E., Lundberg, C. Targeted transgene expression in rat brain using lentiviral vectors. J. Neurosci. Res. 73, 876-885 (2003).
- Arya, S. K., Guo, C., Josephs, S. F., Wong-Staal, F. Trans-activator gene of human T-lymphotropic virus type III (HTLV-III). Science. 229, 69-73 (1985).
- Sirven, A. The human immunodeficiency virus type-1 central DNA flap is a crucial determinant for lentiviral vector nuclear import and gene transduction of human hematopoietic stem cells. Blood. 96, 4103-4110 (2000).
- Burns, J. C., Friedmann, T., Driever, W., Burrascano, M., Yee, J. K. Vesicular stomatitis virus G glycoprotein pseudotyped retroviral vectors: concentration to very high titer and efficient gene transfer into mammalian and nonmammalian cells. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 90, 8033-8037 (1993).
- Farson, D. A new-generation stable inducible packaging cell line for lentiviral vectors. Hum. Gene Ther. 12, 981-997 (2001).
- Broussau, S. Inducible packaging cells for large-scale production of lentiviral vectors in serum-free suspension culture. Mol. Ther. 16, 500-507 (2008).
- Wang, X., McManus, M. Lentivirus production. J. Vis. Exp. (32), e1499 (2009).
- Sastry, L., Johnson, T., Hobson, M. J., Smucker, B., Cornetta, K. Titering lentiviral vectors: comparison of DNA, RNA and marker expression methods. Gene Ther. 9, 1155-1162 (2002).
- Snider, B. J., Lobner, D., Yamada, K. A., Choi, D. W. Conditioning heat stress reduces excitotoxic and apoptotic components of oxygen-glucose deprivation-induced neuronal death in vitro. J. Neurochem. 70, 120-129 (1998).
- Mazarakis, N. D. Rabies virus glycoprotein pseudotyping of lentiviral vectors enables retrograde axonal transport and access to the nervous system after peripheral delivery. Hum. Mol. Genet. 10, 2109-2121 (2001).
- Kato, S. Neuron-specific gene transfer through retrograde transport of lentiviral vector pseudotyped with a novel type of fusion envelope glycoprotein. Hum. Gene Ther. 22, 1511-1523 (2011).
- Segura, M. M., Garnier, A., Durocher, Y., Ansorge, S., Kamen, A. New protocol for lentiviral vector mass production. Methods Mol. Biol. 614, 39-52 (2010).
- Kutner, R. H., Puthli, S., Marino, M. P., Reiser, J. Simplified production and concentration of HIV-1-based lentiviral vectors using HYPERFlask vessels and anion exchange membrane chromatography. BMC Biotechnol. 9, 10 (2009).
- Laughlin, M. A., Chang, G. Y., Oakes, J. W., Gonzalez-Scarano, F., Pomerantz, R. J. Sodium butyrate stimulation of HIV-1 gene expression: a novel mechanism of induction independent of NF-kappa B. J Acquir Immune Defic Syndr Hum Retrovirol. 9, 332-339 (1995).
- Gasmi, M. Requirements for efficient production and transduction of human immunodeficiency virus type 1-based vectors. J. Virol. 73, 1828-1834 (1999).
- Palsson, B., Andreadis, S. The physico-chemical factors that govern retrovirus-mediated gene transfer. Exp. Hematol. 25, 94-102 (1997).
- Lizee, G. Real-time quantitative reverse transcriptase-polymerase chain reaction as a method for determining lentiviral vector titers and measuring transgene expression. Hum. Gene Ther. 14, 497-507 (2003).
- Lee, J. K., Chung, J., McAlpine, F. E., Tansey, M. G. Regulator of G-Protein Signaling-10 Negatively Regulates NF-{kappa}B in Microglia and Neuroprotects Dopaminergic Neurons in Hemiparkinsonian Rats. J. Neurosci. 31, 11879-11888 (2011).
- Shevtsova, Z., Malik, J. M., Michel, U., Bahr, M., Kugler, S. Promoters and serotypes: targeting of adeno-associated virus vectors for gene transfer in the rat central nervous system in vitro and in vivo. Exp. Physiol. 90, 53-59 (2005).
