Isolatie van humane navelstreng endotheel cellen en hun gebruik in de studie van de neutrofielen transmigratie onder stroomtoestanden
Summary
In dit artikel wordt eerst een procedure voor het isoleren van humane endotheelcellen van de navelstreng aderen en dan laat zien hoe deze cellen te gebruiken om neutrofielen transmigratie onderzoeken op stromingscondities. Door een laag volume stromingskamer gemaakt van een polymeer met de optische eigenschappen van glas levende cellen fluorescerende beeldvorming zeldzame celpopulaties is ook mogelijk.
Abstract
Neutrofielen zijn de meest voorkomende type witte bloedcel. Ze vormen een belangrijk deel van het aangeboren immuunsysteem 1. Tijdens de acute ontsteking van de neutrofielen, zijn de eerste inflammatoire cellen om te migreren naar de plaats van verwonding. Aanwerving van neutrofielen een blessure site is een stapsgewijs proces dat eerste, verwijding van de bloedvaten om de bloedstroom te verhogen omvat, ten tweede, microvasculaire structurele veranderingen en te ontsnappen van de plasma-eiwitten uit de bloedbaan, ten derde, walsen, adhesie en transmigratie van de neutrofielen over de endotheel en vierde accumulatie van neutrofielen op de plaats van schade 2,3. Een breed scala van in vivo en in vitro-methoden heeft ontwikkeld tot de studie van deze processen 4 mogelijk te maken. Deze methode richt zich op neutrofielen transmigratie in humane endotheelcellen.
Een populaire methode voor de behandeling van de moleculaire processen die betrokken zijn bij neutrofielen transmigratie maakt gebruik van de menselijke neutrophils interactie met primaire humane umbilicale ader endotheel cellen (HUVEC) 5. Neutrofielen isolatie is visueel elders 6 beschreven; dus dit artikel zal de methode aan te tonen voor isolatie van HUVEC. Eenmaal geïsoleerd en gekweekt tot confluentie worden endotheelcellen geactiveerd waardoor de regulatie van adhesie en activering moleculen. Bijvoorbeeld activering van endotheelcellen met cytokines, zoals TNF-α resulteert in hogere E-selectine en IL-8 expressie 7. E-selectine bemiddelt vangen en rolling van neutrofielen en IL-8 bemiddelt activering en stevige hechting van neutrofielen. Na hechting neutrofielen transmigreren. Transmigratie kan paracellularly voorkomen (door middel van endotheelcellen knooppunten) of transcellularly (via de endotheelcellen zelf). In de meeste gevallen zijn deze interacties plaatsvinden onder stroom staat in het vaatstelsel 7,8.
De parallelle plaat flow kamer is een veel gebruikt systeem dat mimics de hydrodynamische schuifspanningen gevonden in vivo en in staat stelt de studie van de neutrofielen rekrutering onder stroom staat in vitro 9,10. Verschillende bedrijven produceren parallelle plaat flow kamers en hebben elk voor-en nadelen. Als fluorescerende beeldvorming nodig is glas of een soortgelijk optisch polymeer moet worden gebruikt. Endotheelcellen niet goed groeien op glas.
Hier presenteren we een eenvoudige en snelle methode voor fase-contrast, DIC en fluorescerende beeldvorming van neutrofielen transmigratie het gebruik van een laag volume ibidi kanaal glijbaan van een polymeer die ondersteuning biedt voor de snelle hechting en de groei van menselijke endotheelcellen en heeft optische eigenschappen die vergelijkbaar zijn met glas. In deze methode werden endotheelcellen gekweekt en gestimuleerd een ibidi μslide. Neutrofielen werden geïntroduceerd onder stromingscondities en transmigratie werd beoordeeld. Fluorescerende beeldvorming van de knooppunten in staat real-time bepaling van de omvang van paracellulaire versustranscellulair transmigratie.
Protocol
Discussion
Onderzoekers hebben routinematig gebruikt endotheelcellen van verschillende vasculaire bedden tot neutrofielen werving en transmigratie te bestuderen. Voorbeelden omvatten, maar zijn niet beperkt tot, dermale microvasculaire endotheliale cellen 12, lever sinusoïdale endotheelcellen 13 en endotheelcellen van humane umbilicale ader 10. Onder hen HUVEC opgedaan grote populariteit vanwege hun relatieve gemak van isolatie en beschikbaarheid. HUVEC zijn een krachtig in vitro mo…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wij danken Dr Pina Colarusso en de live cell imaging faciliteit voor hun hulp bij beeldvorming en beeldanalyse, mevrouw Lailey voor haar technische bijstand, en eenheid 51 aan de voet Hospital in Calgary, AB voor het verstrekken van de menselijke navelstrengen. Dr KD Patel is een Alberta innoveert: Health Solutions Scientist. Dit werk werd ondersteund door een exploitatiesubsidie van de Canadese Institutes for Health Research en uitrusting en infrastructuur subsidies van de Canadese Stichting voor Innovatie en de Alberta Wetenschap en Onderzoek Autoriteit.
Materials
| Reagent and Equipment | Company | Catalogue number | Comments |
| Collagenase Type 1 | Worthington | 4197 | |
| Cord buffer | Composition: 140 mM NaCl 4 mM KCl 10 mM D-glucose in 1mM NaH2PO4/Na2HPO4 buffer at pH 7.4 | ||
| Endothelial Cell Media (ECM) | M199 with eagle salts supplemented with 16% human serum containing 100 units of penicillin 100 μg of streptomycin and 0.3 mg of L-glutamine/ml | ||
| M199 | GIBCO | 31100-035 | |
| Penicillin Streptomycin Glutamate (100X) | Invitrogen | 10378-016 | |
| Ibidi chambers | Ibidi | 80606 | |
| TNF-α | Prepro Tech | 300-01A | |
| Human Albumin 20% solution | Gemini Bioproducts | 800120050 | |
| HBSS without Ca2+ and Mg2+ | Sigma | H2487-10X | |
| HBSS with Ca2+ and Mg2+ | Sigma | H1387-10X |
References
- Nathan, C. Neutrophils and immunity: challenges and opportunities. Nat. Rev. Immunol. 6, 173-182 (2006).
- Diacovo, T. G. Neutrophil rolling, arrest, and transmigration across activated, surface-adherent platelets via sequential action of P-selectin and the beta 2-integrin CD11b/CD18. Blood. 88, 146-157 (1996).
- Ley, K. Getting to the site of inflammation: the leukocyte adhesion cascade updated. Nat. Rev. Immunol. 7, 678-689 (2007).
- Petri, B. Endothelial LSP1 is involved in endothelial dome formation, minimizing vascular permeability changes during neutrophil transmigration in vivo. Blood. 117, 942-952 (2011).
- Chavakis, T. The junctional adhesion molecule-C promotes neutrophil transendothelial migration in vitro and in vivo. J. Biol. Chem. 279, 55602-55608 (2004).
- Oh, H., Siano, B., Diamond, S. Neutrophil Isolation Protocol. J. Vis. Exp. (17), e745 (2008).
- Liu, Y. Regulation of leukocyte transmigration: cell surface interactions and signaling events. J. Immunol. 172, 7-13 (2004).
- Alcaide, P. Neutrophil recruitment under shear flow: it’s all about endothelial cell rings and gaps. Microcirculation. 16, 43-57 (2009).
- Jutila, M. A. Measurement of neutrophil adhesion under conditions mimicking blood flow. Neutrophil Methods and Protocols. 412, 239-256 (2007).
- Cuvelier, S. L., Patel, K. D. Studying leukocyte rolling and adhesion in vitro under flow conditions. Basic Cell Culture Protocols. 290, 331-342 (2005).
- Wiese, G., Barthel, S. R., Dimitroff, C. J. Analysis of Physiologic E-Selectin-Mediated Leukocyte Rolling on Microvascular Endothelium. J. Vis. Exp. (24), e1009 (2009).
- Petzelbauer, P. Heterogeneity of dermal microvascular endothelial cell antigen expression and cytokine responsiveness in situ and in cell culture. J. Immunol. 151, 5062-5072 (1993).
- Bonder, C. S., Kubes, P. Modulating leukocyte recruitment to splanchnic organs to reduce inflammation. Am J Phys – Gastrointestinal and Liver Phys. 284, G729-G733 (2003).
- Cuvelier, S. L. Eosinophil adhesion under flow conditions activates mechanosensitive signaling pathways in human endothelial cells. J. Exp. Med. 202, 865-876 (2005).
- Massia, S. P., Hubbell, J. A. Human endothelial cell interactions with surface-coupled adhesion peptides on a nonadhesive glass substrate and two polymeric biomaterials. J. Biomed. Mat. Res. 25, 223-242 (1991).
