Isolering av humana navelvenendotelceller och deras användning i studier av neutrofilinhibitorfaktor Transmigration Under flödesförhållanden
Summary
Den här artikeln beskriver först ett förfarande för att isolera humana endotelceller från navel vener och visar sedan hur man använder dessa celler för att undersöka neutrofila själavandring i flöde. Genom att använda en låg volym flödeskammare tillverkad av en polymer med de optiska egenskaperna hos glas är levande cellen fluorescerande avbildning av sällsynta cellpopulationer också möjlig.
Abstract
Neutrofiler är den mest förekommande typ av vita blodkroppar. De utgör en väsentlig del av det medfödda immunförsvaret 1. Under akut inflammation, neutrofiler är de första inflammatoriska celler att migrera till stället för skadan. Rekrytering av neutrofiler till ett skadeställe är en stegvis process som innefattar första, dilation av blodkärl för att öka blodflödet, för det andra mikrovaskulära strukturella förändringar och utströmning av plasmaproteiner från blodomloppet, tredje, valsning, adhesion och den neutrofila över endotelet; och fjärde ackumulering av neutrofiler vid stället för skada 2,3. Ett brett spektrum av in vivo och in vitro-metoder har utvecklats för att möjliggöra studium av dessa processer 4. Denna metod är inriktad på neutrofil transmigration över humana endotelceller.
En populär metod för att undersöka de molekylära processer som är involverade i neutrofila själavandring använder humant Neutrophils interagerar med primära humana navelvenendotelceller (HUVEC) 5. Neutrofil isolering har beskrivits visuellt håll 6, alltså den här artikeln kommer att visa metoden för isolering av HUVEC. När den väl isolerats och odlades till konfluens, är endotelceller aktiveras resulterar i uppreglering av adhesionsmolekyler och aktivering molekyler. Exempelvis aktivering av endotelceller med cytokiner såsom TNF-a resulterar i ökad E-selektin och IL-8-uttryck 7. E-selektin medierar infångnings-och valsning av neutrofiler och IL-8 medierar aktivering och fast vidhäftning av neutrofiler. Efter vidhäftning neutrofiler transmigrera. Transmigration kan inträffa paracellularly (genom endotelceller föreningspunkter) eller transcellularly (genom endotelceller i sig). I de flesta fall är dessa interaktioner sker enligt flödesbetingelser som finns i kärlsystemet 7,8.
Den parallella plattan flödeskammare är en allmänt använd system som miMikrofonerna den hydrodynamiska skjuvpåkänningar återfinnes in vivo och möjliggör studiet av neutrofil rekrytering enligt flödestillstånd in vitro 9,10. Flera företag producerar parallella kamrar platta flöde och var och en har fördelar och nackdelar. Om fluorescerande avbildning behövs måste glas eller en optiskt liknande polymer kan användas. Endotelceller växer inte bra på glas.
Här presenterar vi en enkel och snabb metod för fas kontrast, DIC och fluorescerande avbildning av neutrofiler själavandring med en låg volym ibidi CHANNEL gjord av en polymer som stöder den snabba vidhäftning och tillväxt av humana endotelceller och har optiska egenskaper som är jämförbara med glas. I denna metod var endotelceller odlades och stimulerades i en ibidi μslide. Neutrofiler infördes i flödesförhållanden och transmigration bedömdes. Fluorescerande avbildning av övergångarna aktiverat i realtid bestämning av omfattningen av paracellulära kontratranscellulär transmigration.
Protocol
Discussion
Forskare har rutinmässigt används endotelceller från olika kärlbäddar att studera neutrofil rekrytering och själavandring. Exempel innefattar, men är inte begränsade till, dermala mikrovaskulära endotelceller 12, lever sinusformade endotelceller 13 och endotelceller från mänsklig navelven 10. Bland dem HUVEC vunnit stor popularitet på grund av deras relativa lätthet av isolering och tillgänglighet. HUVEC är ett kraftfullt in vitro-modellsystem som härmar m?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi tackar Dr Pina Colarusso och levande cell imaging anläggning för deras hjälp med avbildning och bildanalys, Ms Lailey för henne tekniskt stöd, och enhet 51 vid foten sjukhuset i Calgary, AB för att ge människor navelsträngar. Dr KD Patel är ett Alberta innovativt: Health Solutions Scientist. Detta arbete stöddes av driftsbidrag från den kanadensiska Institutes for Health Research och utrustning och infrastruktur bidrag från den kanadensiska stiftelsen för Innovation och Alberta vetenskap och forskning myndigheten.
Materials
| Reagent and Equipment | Company | Catalogue number | Comments |
| Collagenase Type 1 | Worthington | 4197 | |
| Cord buffer | Composition: 140 mM NaCl 4 mM KCl 10 mM D-glucose in 1mM NaH2PO4/Na2HPO4 buffer at pH 7.4 | ||
| Endothelial Cell Media (ECM) | M199 with eagle salts supplemented with 16% human serum containing 100 units of penicillin 100 μg of streptomycin and 0.3 mg of L-glutamine/ml | ||
| M199 | GIBCO | 31100-035 | |
| Penicillin Streptomycin Glutamate (100X) | Invitrogen | 10378-016 | |
| Ibidi chambers | Ibidi | 80606 | |
| TNF-α | Prepro Tech | 300-01A | |
| Human Albumin 20% solution | Gemini Bioproducts | 800120050 | |
| HBSS without Ca2+ and Mg2+ | Sigma | H2487-10X | |
| HBSS with Ca2+ and Mg2+ | Sigma | H1387-10X |
References
- Nathan, C. Neutrophils and immunity: challenges and opportunities. Nat. Rev. Immunol. 6, 173-182 (2006).
- Diacovo, T. G. Neutrophil rolling, arrest, and transmigration across activated, surface-adherent platelets via sequential action of P-selectin and the beta 2-integrin CD11b/CD18. Blood. 88, 146-157 (1996).
- Ley, K. Getting to the site of inflammation: the leukocyte adhesion cascade updated. Nat. Rev. Immunol. 7, 678-689 (2007).
- Petri, B. Endothelial LSP1 is involved in endothelial dome formation, minimizing vascular permeability changes during neutrophil transmigration in vivo. Blood. 117, 942-952 (2011).
- Chavakis, T. The junctional adhesion molecule-C promotes neutrophil transendothelial migration in vitro and in vivo. J. Biol. Chem. 279, 55602-55608 (2004).
- Oh, H., Siano, B., Diamond, S. Neutrophil Isolation Protocol. J. Vis. Exp. (17), e745 (2008).
- Liu, Y. Regulation of leukocyte transmigration: cell surface interactions and signaling events. J. Immunol. 172, 7-13 (2004).
- Alcaide, P. Neutrophil recruitment under shear flow: it’s all about endothelial cell rings and gaps. Microcirculation. 16, 43-57 (2009).
- Jutila, M. A. Measurement of neutrophil adhesion under conditions mimicking blood flow. Neutrophil Methods and Protocols. 412, 239-256 (2007).
- Cuvelier, S. L., Patel, K. D. Studying leukocyte rolling and adhesion in vitro under flow conditions. Basic Cell Culture Protocols. 290, 331-342 (2005).
- Wiese, G., Barthel, S. R., Dimitroff, C. J. Analysis of Physiologic E-Selectin-Mediated Leukocyte Rolling on Microvascular Endothelium. J. Vis. Exp. (24), e1009 (2009).
- Petzelbauer, P. Heterogeneity of dermal microvascular endothelial cell antigen expression and cytokine responsiveness in situ and in cell culture. J. Immunol. 151, 5062-5072 (1993).
- Bonder, C. S., Kubes, P. Modulating leukocyte recruitment to splanchnic organs to reduce inflammation. Am J Phys – Gastrointestinal and Liver Phys. 284, G729-G733 (2003).
- Cuvelier, S. L. Eosinophil adhesion under flow conditions activates mechanosensitive signaling pathways in human endothelial cells. J. Exp. Med. 202, 865-876 (2005).
- Massia, S. P., Hubbell, J. A. Human endothelial cell interactions with surface-coupled adhesion peptides on a nonadhesive glass substrate and two polymeric biomaterials. J. Biomed. Mat. Res. 25, 223-242 (1991).
