التصوير المقطعي الموجهة التصوير المقطعي منتشر الوقت المجال الإسفار في الحيوانات الصغيرة من أجل الترجمة من المؤشرات الحيوية للسرطان

Summary

التصوير المقطعي مضان منتشر يقدم نهجا منخفضة التكلفة نسبيا ويحتمل أن تكون عالية في جميع أنحاء إلى ما قبل السريرية<em> في الجسم الحي</em> التصوير الورم. يتم تقديم منهجية لجمع البيانات البصرية، والمعايرة، وإعادة بناء صورة عن التصوير المقطعي الموجهة محسوب نظام للوقت نطاق عدم الاتصال باستخدام فلوري استهداف العلامات البيولوجية ورم البشرة مستقبلات عوامل النمو في الفأر نموذج دبقي.

Abstract

Small animal fluorescence molecular imaging (FMI) can be a powerful tool for preclinical drug discovery and development studies¹. However, light absorption by tissue chromophores (e.g., hemoglobin, water, lipids, melanin) typically limits optical signal propagation through thicknesses larger than a few millimeters². Compared to other visible wavelengths, tissue absorption for red and near-infrared (near-IR) light absorption dramatically decreases and non-elastic scattering becomes the dominant light-tissue interaction mechanism. The relatively recent development of fluorescent agents that absorb and emit light in the near-IR range (600-1000 nm), has driven the development of imaging systems and light propagation models that can achieve whole body three-dimensional imaging in small animals³.

Despite great strides in this area, the ill-posed nature of diffuse fluorescence tomography remains a significant problem for the stability, contrast recovery and spatial resolution of image reconstruction techniques and the optimal approach to FMI in small animals has yet to be agreed on. The majority of research groups have invested in charge-coupled device (CCD)-based systems that provide abundant tissue-sampling but suboptimal sensitivity^4-9, while our group and a few others^10-13 have pursued systems based on very high sensitivity detectors, that at this time allow dense tissue sampling to be achieved only at the cost of low imaging throughput. Here we demonstrate the methodology for applying single-photon detection technology in a fluorescence tomography system to localize a cancerous brain lesion in a mouse model.

The fluorescence tomography (FT) system employed single photon counting using photomultiplier tubes (PMT) and information-rich time-domain light detection in a non-contact conformation¹¹. This provides a simultaneous collection of transmitted excitation and emission light, and includes automatic fluorescence excitation exposure control¹⁴, laser referencing, and co-registration with a small animal computed tomography (microCT) system¹⁵. A nude mouse model was used for imaging. The animal was inoculated orthotopically with a human glioma cell line (U251) in the left cerebral hemisphere and imaged 2 weeks later. The tumor was made to fluoresce by injecting a fluorescent tracer, IRDye 800CW-EGF (LI-COR Biosciences, Lincoln, NE) targeted to epidermal growth factor receptor, a cell membrane protein known to be overexpressed in the U251 tumor line and many other cancers¹⁸. A second, untargeted fluorescent tracer, Alexa Fluor 647 (Life Technologies, Grand Island, NY) was also injected to account for non-receptor mediated effects on the uptake of the targeted tracers to provide a means of quantifying tracer binding and receptor availability/density²⁷. A CT-guided, time-domain algorithm was used to reconstruct the location of both fluorescent tracers (i.e., the location of the tumor) in the mouse brain and their ability to localize the tumor was verified by contrast-enhanced magnetic resonance imaging.

Though demonstrated for fluorescence imaging in a glioma mouse model, the methodology presented in this video can be extended to different tumor models in various small animal models potentially up to the size of a rat¹⁷.

Protocol

1. حيوان التحضير تخدير الفأر عارية (نهر تشارلز، ويلمنجتون، MA) مع حقن داخل الصفاق من زيلازين-الكيتامين (100 ملغ / كلغ: 10 مغ / كغ IP). الماوس مكان في إطار المجسم، إجراء شق في فروة الرأس على الجانب الأيمن من الجمجمة، وباستخدام إبرة عيار 18، وخلق 1 مم القطر ثقب في الجمجمة 2 مم من خط الوسط و2 مم وراء bregma. حقن 5 × 10 5 U251 خلايا ورم أرومي دبقي العصبية (تفضلت التي تقدمها الدكتور مارك اسرائيل في كلية دارتموث، هانوفر، نيو هامبشاير) في 5 ميكرولتر من حل العازلة الفوسفات في نصف الكرة المخية الأيسر على عمق حوالي 2 ملم تحت سطح الدماغ. انتهت استخدام هاملتون الصغيرة محقنة 18 و صريحا في 27 عيار إبرة لزرع الخلايا وإدراج غيض من 3 ملم إبرة من السطح الخارجي للجمجمة، ثم الانسحاب من 1 ملم إلى خلق جيب للخلايا. خاط موقع شق، والسماح بإعادةcovery من عملية جراحية. ~ الانتظار 14 يوما للسماح للورم أن ينمو قبل التصوير. 2. مضان معايرة نظام التصوير المقطعي في يوم التصوير الماوس، والشروع في نظام والسماح ليزر وأجهزة الكشف عن الضوء لالاحماء لحوالي 20 دقيقة لتجنب الانجراف في حساسية النظام. وضع 100 درجة على حدة 4 درجات هندسيا diffusor خط (Thorlabs، نيوتن، نيوجيرسي) في المركز المباشر للعملاق التصوير، وطبيعي ليزر إثارة: أ بيكو ثانية، نابض 80 ميغاهيرتز المتعدد نانومتر ليزر ديود 635 (PicoQuant الضوئيات الشمال أمريكا وشركة، ويستفيلد، MA). ضبط زاوية diffusor لتعظيم كمية من إشارة الكشف عنها من قبل جميع القنوات ضوء جمع خمس سنوات. ويرد وصف كامل للهندسة والتصوير في مكان آخر 11،14،15. وضع OD 2 مرشحات الكثافة محايدة (Thorlabs، نيوتن، نيو جيرسي) أمام جميع أنابيب كشف مضخم ضوئي مضان (PMT) وOD 1 كثافة مرشحات محايد (ثorlabs، نيوتن، نيو جيرسي) أمام كل فرق إدارة المشاريع PMT كشف النفاذية. جمع 100 انتشار نبض الزمنية ملامح (TPSF) ليزر، مع كل مرة التكامل 1-S. تطبيع كل TPSF من الإشارة الليزر، والصحيح من أجل الانجراف الزمنية في إشارة ليزر، ومتوسط ​​فوق كل تكرار لكل كاشف. هذه TPSFs المتوسط ​​هي استجابة أداة للكشف عن وظائف محددة (IRF) المستخدمة في إعادة الإعمار الصورة البصرية. 3. التصوير البروتوكول تخدير الماوس مع 2٪ isoflurane في الأوكسجين (1 لتر / دقيقة). 1 حقن nanomole من IRDye-800CW EGF و 1 nanomole من فلور اليكسا 647 في 100 ميكروليتر من محلول منظم فوسفات، intraperitoneally، 12 ساعة قبل التصوير لاستهداف البشرة مستقبلات عوامل النمو overexpression في الورم. ضع الماوس على والألياف الزجاجية يدعم من السرير والتصوير، وترتيب الماوس بحيث أنفها يبقى في مخروط تقديم التخدير isoflurane. ENتأكد من أن يتم وضع الماوس بشكل مناسب على السرير: أي أنه عندما يتم تأمين سرير في نظام التصوير المقطعي مضان الفأر هو في المركز التقريبي للعملاق التصوير. ويمكن أن تسترشد هذه المواقع من خلال تناوب إثارة ليزر 180 درجة عن الماوس، وضمان أن النقطة المحورية ليزر يضيء نقطة تقريبا في وسط الفأرة من وجهة نظر ليزر في جميع الزوايا. وضعه مرة واحدة، بعناية نقل السرير التصوير والماوس إلى microCT (استكشاف المثول أمام المحاكم، شركة جنرال الكتريك للرعاية الصحية، لندن، ON) الماسح الضوئي وجمع المعلومات التشريحية في قرار من 93 ميكرومتر الخواص لرئيس كل من الفأرة. تصور المكدس صورة CT واختيار شريحة (ق) ليتم تصويرها مع نظام التصوير المقطعي مضان. نقل بعناية على السرير والتصوير والفأر مرة أخرى إلى نظام التصوير المقطعي مضان. اختيار عدد من المناصب مصدر لجمع البيانات حول الماوس لكل SLIC التصويره (32)، في الوقت التكامل لكل قياس TPSF (1 ق)، وعدد التكرارات لكل منصب المصدر (10)، وموقف وعدد من شرائح التصوير المرجوة من المكدس صورة CT من الخطوة 3.6. الأرقام الواردة بين قوسين هي قيم نموذجية لكل معلمة التصوير الرضوخ ~ 5 دقائق من الحصول على البيانات في شريحة التصوير. وضع الفلاتر درجة الثلاثي (كروما شركة تكنولوجيا، الخوار فولز، VT) أمام فرق إدارة المشاريع PMT كشف مضان، للحد من أي ضوء الليزر من الوصول الى كشف مضان، والتطوير التنظيمي 2 مرشحات الكثافة محايدة أمام فرق إدارة المشاريع PMT كشف النفاذية لتجنب التشبع للكشف عن تلك. تشغيل البرنامج الحصول على البيانات، وجمع ومضان TPSFs النفاذية في كل موقف للكشف عن مصدر محدد ولكل طول موجي إثارة (635 نانومتر و 755 لإثارة فلور اليكسا 647 وIRDye استشفاف-800CW EGF، على التوالي). لكل مجموعة من جمعها TPSFs، رصد وتسجيل كثافة الليزرمع إشارة قناة PMT. 4. صورة إعادة الإعمار تحديد السطح الخارجي للفأرة وموقع التصوير قضبان الدعم السرير من الصور المقطعية وخلق أقنعة تغطي حدود الماوس وقضبان التصوير بشكل منفصل. استخدام قناع فأر لانتاج شبكة محدود، عنصر من عناصر حيوان باستخدام برنامج NIRFAST 19. توطين الوظائف وكشف مصدر من نظام التصوير المقطعي مضان على السطح للشبكة على أساس microCT وتسجيل المكانية مضان تنسق 20. إزالة بصري نقاط البيانات المرتبطة مواقف أو للكشف عن مصدر التي تتفاعل مع مكان التصوير دعم قضبان السرير. تطبيع البيانات التي تم جمعها في كل موقف للكشف عن مصدر من الإشارة الليزر، والصحيح من أجل الانجراف الزمنية في إشارة ليزر، والصحيح للحساسيات مرشح، والتي تم تحديدها عن طريق الاختبار التجريبي في وقت الشراء 15. أخذ نسبة ولد من البيانات (مضان مقسوما النفاذية) لكل موقف المصدر للكشف عن وتتضاعف مع محاكاة النموذج إلى الأمام من النفاذية على أساس شبكة الحيوانية محدود، لعنصر الخصائص البصرية موحدة. يتم ذلك للتخفيف من الأخطاء المرتبطة توصيل المصدر أو للكشف عن الأنسجة-21، لمعايرة البيانات إلى نموذج 22، وتعديل البيانات لجوانب أخرى من نموذج البيانات عدم تطابق 23،24. بناء ناقلات البيانات تتألف من فرق مصغرة للبيانات التي تم جمعها نسبة المولودين في كل من موجات. يتم اختيار عامل التحجيم لتعظيم EGFR النقيض ملزم. نفذ وقت نطاق إعادة الإعمار صورة مع البيانات الفرق معايرتها باستخدام TPSF لكل قناة كشف كمدخل، وخلق خرائط مضان من التتبع على النقيض المعززة استهدفت 15. 5. ممثل النتائج "> مثال لاعادة الاعمار مضان مضافين مع صورة المشارك المسجلة التشريحية CT من رأس الفأر مع يتم تقديم U251 ورم دبقي orthotopic في الشكل 1B. مركز الكتلة من دبقي يحددها إعادة الإعمار فلوري (الشكل 1B ) كان في حدود 1 ملم من مركز الورم من كتلة يحددها تعزيز التباين التصوير بالرنين المغناطيسي (الشكل 1A). وشارك في تسجيل يستند الصور المقطعية والتصوير بالرنين المغناطيسي على تحويل المعلومات المتبادلة. الشكل 1. على النقيض من محسن (الجادولينيوم) صورة بالرنين المغنطيسي من رأس الفأر (أ). تم تلقيح الماوس orthotopically مع U251 الإنسان دبقي خط الخلية. يمكن النظر إلى مكان الورم، والتي تمتص أكثر من وكيل النقيض من الدماغ العادي، في نصف الكرة المخية الأيسر (اليمين في الصورة)، والذي يشير إليه السهم الأبيض. وcorrespondinويصور ز صورة التصوير المقطعي (من نفس الموقع على رأس الماوس) في (ب) مع عامل نمو البشرة استهدفت مضان ناقص غير مستهدفة مضافين إعادة الإعمار مضان. وحدات من التألق في معكوس مم، وتتصل معامل امتصاص مضان المستهدفة متجهة مضروبا كفاءتها الكم وتركيزه.

Discussion

مضان التصوير المقطعي (FT) هو، المؤينة الحساسة إشعاع حر طريقة التصوير الجزيئي على أساس نقل الضوء المرئي والأشعة تحت الحمراء بالقرب من خلال الأنسجة البيولوجية. وقد تركز معظم الاهتمام في FT في قدرتها على تسريع اكتشاف المخدرات والتنمية في الحيوانات الصغيرة نماذج تجريبية ⁽¹⁾ واحدة من المجالات الرئيسية للبحوث وكانت دراسة التعبير العلامات البيولوجية السرطان وردا على العلاجات الجزيئية ^26. في الوقت الحاضر، هناك طريقتان للتنافس على تصميم نظام FT. يرتكز في تصميمه الأكثر شيوعا في تبريد المسؤول عن الكاميرات الديناميكي (CCD) جهاز للكشف عن مضان ^4-9. هذا التصميم يوفر كثافة عالية من القياسات، وأخذ عينات الأنسجة منذ تعظيم كل بكسل في كاميرا CCD يمكن الكشف عن الضوء الذي قد سافر مسار فريدة من نوعها من خلال النسيج. ومع ذلك، والكاميرات لاتفاقية مكافحة التصحر لديها مجموعة محدودة ديناميكية وقراءة خارج الضوضاء يحد من حساسية في نهاية المطاف. تصميم 2 يتجنب limita المحتملة ستعقد من كشف كاميرا CCD من خلال توظيف تكنولوجيا حساسة للغاية العد واحد الفوتون تعتمد على استخدام أجهزة الكشف عن مثل أنابيب مضخم ضوئي أو فوتوديوديس سيل ^10-13. العيب من هذه الأساليب اكتشاف أكثر حساسية هو أن كل كاشف يمكن جمع ضوء فقط في نقطة واحدة، وبالتالي، لتحقيق كثافة أخذ عينات الأنسجة، وإما للكشف عن كثير لا بد من استخدامها (وهو أمر مكلف جدا)، أو توقعات كثير لا بد من تصوير مع الكشف عن نفسه (والذي يمكن أن يكون مضيعة للوقت). في حين أن المستوى الأمثل للأخذ عينات الأنسجة لFT حيوان صغير لم يتم الاتفاق عليها، ويمكن أن تختلف على أساس كل حالة على حدة، من المتفق عليه أن هو أكثر ملاءمة أحادية الفوتون الأجهزة عد لاستكشاف حدود حساسية من حيث FT من قدرتها على الكشف عن تركيزات منخفضة من المؤشرات الجزيئية. في هذه الدراسة، ونحن نقدم منهجية لتنفيذ FT باستخدام واحد الفوتون أجهزة كشف الحساب في توطين الاورام في الفئران.

والأنف والحنجرة "> هناك أربع خطوات حاسمة المعنية لإنتاج مجموعات بيانات قوية مع FT أحادية الفوتون الوقت مترابطة العد. الأول هو الخضوع لإجراء معايرة مناسبة ومباشرة. في المنهجية المقدمة، تحتسب الحساسيات الخاصة بكل قناة كشف عن طريق جمع قياس خط الأساس للضوء الإثارة التي تنتقل عن طريق diffusor الخط تهدف إلى توجيه أجزاء متساوية من الضوء على كل كشف ^15. وعلاوة على ذلك، يتم معايرة بشكل مستمر على ضوء الكشف عن أثناء تجربة لمرجع ليزر، سواء من حيث الكثافة وتعني . في الوقت الذي يمكن أن تتقلب مع مرور الوقت، من خلال تشغيل قناة مرجع ليزر ^11،15 الخطوة الثانية الحاسمة هي مجموعة دقيقة والمشارك التسجيل من الصور التشريحية لاعادة البناء مضان موجه البيانات FT تقدم وحدها أي معلومات تشريحية. ولذلك، من أجل خلق نموذج وسائل النقل الخفيفة التي يمكن استخدامها لإعادة بناء الصغرىالكاتيون من مصادر فلوري خلال عينة من مضان الكشف على سطح العينة، لا بد من تشريح العينة بالنسبة إلى نظام FT معروف بدقة. في نظامنا، ويتم الحصول على المعلومات التشريحية عن طريق نظام التصوير المقطعي الصغيرة المحسوبة مع الإحداثيات المكانية التي تم تسجيلها مكانيا مع تلك التابعة لمنظومة FT ^15،20. الخطوة الثالثة الحاسمة ينطوي على ضمان أن يعمل التعرض الأمثل (أي مجموع وقت كشف الفوتون لكل إسقاط ليزر) في كل موقف للكشف عن المصدر. وهذا أمر مهم لسببين: أولا، لضمان عدم وجود إشارة كافية إلى الضجيج في كل موقف الكشف والثاني لتجنب الكشف عن التشبع، والتي يمكن ان يلحق الضرر وحدات الكشف. من أجل تحقيق التعرض الأمثل في كل موقف كاشف، يعمل عنصر تحكم التعرض التلقائي، الذي triangulates أساسا التعرض الأمثل من اثنين، ومنخفضة التعرض للإشارة ^14. الحرجة 4خطوة من خطوات منهجية يتم الرجوع إلى البيانات التي تم جمعها مضان على كمية الضوء إثارة المنقولة. وغالبا ما تسمى هذه الإشارة إلى نسبة ولد، وتوفر العديد من المزايا لFT، مع أهمها التخفيف من أخطاء عدم تطابق نموذج البيانات ^23،24. تم تصميم هذا النظام قدم لكشف كل من التألق وينتقل ضوء الإثارة في وقت واحد عن طريق توجيه الضوء في كل قناة الاكتشاف الى 2 أنابيب مضخم ضوئي منفصلة. من خلال ذلك، يمكننا تجنب أي تأثيرات الحركة على دقة نسبة ولد.

مع مجموعة بيانات قوية يدها، وإعادة بناء صورة من الوقت للنطاق البيانات ينطوي على حل مشكلة معكوس شبكة العناصر المحدودة لديها التعبير:

د = JX

حيث d هو متجه مع عناصر ن متر x لتوقعات المصدر كشف n و m TPSF بوابات الزمن؛ J هو ن س م على حدةل مصفوفة حساسية (أو Jacobian)، لعقد لتر في شبكة، وx هو متجه من الخصائص البصرية مضان في كل عقدة، وكان ل د هو حجم البيانات التي تم جمعها خلال معايرة التجربة وجيه هو محاكاة باستخدام حل العناصر المحددة. لنشر تقريب وقت مجال النقل مضان ^25. وconvolved أيضا في الوقت البعد من J مع كاشف وظائف معينة استجابة الصك. x هو تمثيل لخريطة مضان من الاهتمام ويتم حلها عن استخدام Levenberg-Marqardt غير سلبي نهج المربعات مع تنظيم تيخونوف ^15.

عرض منهجية هنا، والذي يصف إجراء قادرة على توطين أورام fluorescently المسمى في الفئران باستخدام درجة عالية من الحساسية الفوتون عد الكشف عن مضان، لديه القدرة على دفع حدود FT. في دراسة سابقة، فإن إمكانية توظيف هذاوقد تجلى في نهج أكبر من الفئران نماذج الحيوانات مثل الفئران، وكذلك تحسين الحساسية أكثر من التصاميم النظام القائم في فأر بحجم العينات، ^17. فإن التطبيق الفوري لهذا النهج أن يكون لرصد التعبير العلامات البيولوجية في الجسم الحي في نماذج ورم صغير الحيوان لتقييم فعالية الدواء في وسيلة عالية الإنتاجية. قدرة نظام لإثارة وكشف مضان في موجات متعددة في وقت واحد يسمح للكشف عن علامات فلوري متعددة. علامات فلوري إضافية توفر وسيلة لاستجواب جوانب متعددة من علم الأمراض، في وقت واحد، أو يمكن أن تستخدم، كما هو الحال في هذه الدراسة، لتوظيف المناهج التصوير أكثر كمي مثل ثنائي مراسل طرق قياس في إمكانية ملزم الجسم الحي، علامة على كثافة مستقبلات ^26،27.

Materials

Name of the reagent	Company	Catalogue number	Comments (optional)
IRDye 800CW-EGF	LI-COR Biosciences	926-08446
Alexa Fluor 647, succinimidyl ester	Life Technologies	A20106	Reacted with water to minimize non-specific binding