Summary

L'imagerie non invasive de la candidose disséminée chez les larves poisson zèbre

Published: July 30, 2012
doi:

Summary

Le développement rapide, de petite taille et la transparence du poisson zèbre sont des atouts considérables pour l'étude du contrôle immunitaire innée de l'infection<sup> 1-4</sup>. Nous démontrons ici les techniques de larves infectantes poisson-zèbre à l'aide de l'agent pathogène fongique<em> Candida albicans</em> Par microinjection, la méthodologie utilisée récemment pour impliquer phagocyte l'activité de la NADPH oxydase dans le contrôle du dimorphisme fongique<sup> 5</sup>.

Abstract

Candidose disséminée provoquée par l'agent pathogène albicans Candida est un problème cliniquement important dans les individus hospitalisés et est associée à un taux de mortalité 30 à 40% attribuables 6. La candidose systémique est normalement contrôlée par l'immunité innée, et les individus présentant des anomalies génétiques dans des cellules immunitaires innées composants tels que la NADPH oxydase phagocytaire sont plus sensibles à la candidémie 7-9. On sait très peu sur la dynamique de C. l'interaction avec albicans cellules immunitaires innées in vivo. Vaste études in vitro ont établi que, en dehors de l'hôte C. albicans germe à l'intérieur des macrophages, et est rapidement détruite par les neutrophiles 10-14. Des études in vitro, bien qu'utile, ne peut pas résumer le complexe dans un environnement in vivo, qui comprend en fonction du temps la dynamique des niveaux de cytokines, les pièces jointes de la matrice extracellulaire et les contacts intercellulaires 10, 15-18 </sup>. Afin de sonder la contribution de ces facteurs dans l'interaction hôte-pathogène, il est essentiel de trouver un organisme modèle pour visualiser ces aspects de l'infection non invasive chez un hôte en direct intacte.

La larve du poisson zèbre offre un hôte vertébré unique et polyvalent pour l'étude de l'infection. Pour les 30 premiers jours de développement du poisson zèbre larves n'ont que les défenses immunitaires innées 2, 19-21, simplifier l'étude des maladies telles que la candidose disséminée qui sont fortement tributaires de l'immunité innée. La petite taille et la transparence des larves du poisson zèbre permettre l'imagerie de la dynamique de l'infection au niveau cellulaire à la fois pour l'hôte et le pathogène. Larves transgénique fluorescent avec les cellules immunitaires innées peuvent être utilisés pour identifier les types spécifiques de cellules impliquées dans l'infection 22-24. Modifiés oligonucléotides antisens (morpholinos) peut être utilisé pour abattre diverses composantes immunitaires telles que la NADPH oxydase phagocytaire et d'étudier les changements en réponse à fungal'infection de 5 litres. En plus des avantages éthiques et pratiques de l'aide d'un petit vertébré inférieur, le poisson-zèbre larves offre la possibilité unique de l'image de la bataille rangée entre agents pathogènes et l'hôte à la fois intravitally et en couleur.

Le poisson zèbre a été utilisé à l'infection de modèle pour un certain nombre de bactéries pathogènes pour l'homme, et a joué un rôle dans de grandes avancées dans notre compréhension de l'infection mycobactérienne 3, 25. Toutefois, c'est seulement récemment que les agents pathogènes beaucoup plus grandes, comme des champignons été utilisés pour infecter une larve 5, 23, 26, et à ce jour, il n'a pas été une description visuelle détaillée de la méthodologie d'infection. Ici, nous présentons nos techniques de microinjection ventricule rhombencéphale de prim 25 poisson-zèbre, y compris nos modifications à apporter aux protocoles précédents. Nos résultats en utilisant le modèle de poisson zèbre larves pour l'infection fongique divergent d'études in vitro et de renforcer la nécessité d'examiner l'intera hôte-pathogènection dans l'environnement complexe de l'hôte plutôt que le système simplifié de la boîte de Pétri 5.

Protocol

Tous les protocoles de soins de poisson zèbre et des expériences ont été réalisées sous protection des animaux et le Comité institutionnel d'utilisation (IACUC) protocole A2009-11-01. 1. Morpholino et plats injection larvaires Durée expérimentale: * (10-15 minutes) Degré de difficulté: * Pour les injections d'œufs, de préparer une solution à 2% d'agarose dans de l&…

Discussion

La technique de microinjection poisson zèbre présenté ici diffère de Gutzman et al. 34 en ce que nous démontrons ici l'injection à travers la vésicule otique dans le ventricule du cerveau postérieur de 36 à 48 larves HPF. La méthode que nous décrivons permet pour l'injection constante de 10-15 levure dans le ventricule du cerveau postérieur à une lésion tissulaire réduite. Ce protocole provoque une infection qui se propage d'abord locale dans tout le corps de 24 hpi <strong…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Les auteurs tiennent à remercier le laboratoire du Dr Carol Kim pour la formation de micro-injection, Clarissa Henry pour obtenir des conseils sur l'accélération de développement de l'embryon et l'utilisation de l'équipement, et Nathan Lawson pour contribuer FLI1: poissons EGFP. Nous remercions les membres du laboratoire Wheeler et murs Shawn pour la lecture critique du manuscrit. Nous tenons également à remercier Mark Nilan pour les soins de poissons et de conseils, et Ryan Phennicie et Kristin Gabor pour des conseils techniques sur ce projet. Ce travail a été financé par un assistanat de recherche MAFES Brothers K., un MAFES Hatch subvention E08913-08, et un prix NIH NCRR P20RR016463 à R. Wheeler.

Materials

Name of the reagent Company Catalog number Comments (optional)
Spawning tanks Aquatic habitats  2L  
1.7 mL tubes Axygen MCT-175-C
Instant Ocean Fisher Scientific S17957C  
Extra deep Petri dishes Fisher Scientific 08-757-11Z  
Standard Petri dishes VWR Scientific 25384-302
Transfer pipettes Fisher Scientific 13-711-7M  
Yeast Extract VWR Scientific 90000-726  
Peptone VWR Scientific 90000-264  
Dextrose Fisher Scientific D16-1  
Agar VWR Scientific 90000-760  
Disposable Hemocytometer VWR Scientific 82030-468  
Phosphate Buffered Saline VWR Scientific 12001-986  
Dumont Dumoxel Tweezers VWR Scientific 100501-806  
Wooden Dowels VWR Scientific 10805-018
KimWipes VWR Scientific 300053-964
Low Melt Agarose VWR Scientific 12001-722  
Agarose for injection dishes VWR Scientific 12002-102
Flaming Brown Micropipette Puller Sutter Instruments P-97
Hollow glass rods Sutter Instruments BF120-69-10 For glass rods smooth glass by heating over bunsen burner 
Pipette Storage Box Sutter Instruments BX10
MPPI-3 Injection system Applied Scientific Instrumentation MPPI-3
Back Pressure Unit Applied Scientific Instrumentation BPU  
Micropipette Holder kit Applied Scientific Instrumentation MPIP  
Foot Switch Applied Scientific Instrumentation FSW  
Micromanipulator Applied Scientific Instrumentation MM33  
Magnetic Base Applied Scientific Instrumentation Magnetic Base  
Tricaine methane sulfonate Western Chemical Inc. MS-222  
Dissecting Scope Olympus SZ61 top SZX-ILLB2-100 base  
Confocal Microscope Olympus IX-81 with FV-1000 laser scanning confocal system  
TC-7 Tissue Culture Roller drum with 14 inch test tube wheel New Brunswick Scientific  TC-7  
Imaging Dishes MatTek Corporation P24G-1.0-10-F  
Pipette tips for loading needles Eppendorf 930001007  
Plate pouring grids Adaptive Science Tools TU-1
Heated Stage Bioptechs Inc. Delta T-5
Flat Spatula VWR Scientific 82027-486
Plastic Sieves Wares of Knutsford Online 12 cm
Parafilm VWR Scientific 52858-000
Vortex Genie VWR Scientific 14216-184
16 x 150 mm Culture tubes VWR Scientific 60825-435
Nanodrop Thermo Scientific ND 2000
Phenol Red VWR Scientific 97062-478
HCl VWR Scientific 87003-216
NaCl VWR Scientific BDH4534-500GP
KCl VWR Scientific BDH4532-500GP
MgSO4 VWR Scientific BDH0246-500GP
Ca(NO3)2 VWR Scientific BDH0226-500GP
HEPES VWR Scientific BDH4520-500GP
Morpholinos GeneTools, LLC

References

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Cite This Article
Brothers, K. M., Wheeler, R. T. Non-invasive Imaging of Disseminated Candidiasis in Zebrafish Larvae. J. Vis. Exp. (65), e4051, doi:10.3791/4051 (2012).

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