הכנת Slices האזור Subventricular החריף להדמית סיד
Summary
שיטה לטעון אזור תאי subventricular (SVZ) עם צבעי סיד חיווי לפעילות הסידן הקלטה מתוארת. SVZ לאחר הלידה מכיל תאים צפופים, כולל תאי אב עצביים וneuroblasts. במקום להשתמש בטעינת אמבטיה אנו מזריקים צבע בלחץ בתוך הרקמה המאפשרת דיפוזיה צבע טובה יותר.
Abstract
אזור subventricular (SVZ) הוא אחד משני האזורים במוח neurogenic לאחר הלידה. SVZ מכיל תאים צפופים, כולל תאי אב עצביים עם תכונות astrocytic (הנקרא האסטרוציטים SVZ), neuroblasts, ותאי ביניים. Neuroblasts נולד בSVZ משיק לנדוד מרחק רב כדי נורת חוש הריח, שבו הם להתמיין interneurons. איתות אינטר באמצעות מולקולות דבקות ואותות diffusible ממלאת תפקידים חשובים בneurogenesis שליטה. רבים מאותות אלו לגרום לפעילות הסידן אינטר שמעבירה מידע בתוך ובין תאים. סידן היא פעילות ובכך משקף את הפעילות של אותות תאיים והיא דרך אופטימלית להבין איתות אינטר פונקציונלית בין תאי SVZ.
פעילות סידן נחקרה באזורים רבים אחרים וסוגי תאים, כוללים תאי גליה ונוירונים בוגרים. עם זאת, השיטה המסורתית לואהתאי D עם סיד מחוון צבע (טעינת אמבטיה כלומר) לא היו יעילים בטעינה כל סוגי תאי SVZ. ואכן, בצפיפות הסלולרית SVZ מונעת התפשטות צבע בתוך הרקמה. בנוסף, הכנת פרוסות sagittal יהיה טוב יותר לשמור על ההסדר תלת הממדי של תאים, במיוחד SVZ זרם הגירת neuroblast על הציר מקורי-הזנב.
כאן, אנו מתארים שיטות להכנת סעיפי sagittal המכילים SVZ, הטעינה של תאי SVZ עם צבע מחוון סידן, ורכישת פעילות סידן עם סרטי זמן לשגות. אנחנו השתמשנו Fluo-04:00 לצבוע לטעינת האסטרוציטים SVZ באמצעות יישום לחץ בתוך הרקמה. פעילות סידן נרשמה באמצעות מיקרוסקופ confocal סריקה המאפשר רזולוציה מדויקת לתאים בודדים מזהים. הגישה שלנו היא ישימה לאזורים אחרים, כולל neurogenic האזור המבוגר היפוקמפוס subgranular ואזורי neurogenic עובריים. בנוסף, סוגים אחרים של צבעים יכוליםלהיות מיושם בשיטה שתוארה.
Protocol
Discussion
הדמית סיד של תאי SVZ נעשתה שימוש כדי ללמוד את הדפוסים בפעילות ספונטנית בneuroblasts 10, ערוץ ביטוי הקולטן בשני neuroblasts והאסטרוציטים 4,6,8 וגלי סיד astrocytic 3. מאחר ותאים בSVZ הם או לא בוגרים או בעלי תכונות גליה, הם לא יירו פוטנציאלי פעולה 11,12, כלומר שינויים באלפ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכה על ידי מענקים מהמכון הלאומי לבריאות (DC007681, א.ב.), CT תאי גזע המענק (א.ב.), פארדי היסוד (א.ב.), Predoctoral רות ל Kirschstein שירות מחקר של הפרסים הלאומיים (NRSA) (SZY), ובוגר NSF מחקר מלגה (BL). אנו מודים לחברי מעבדת Bordey על הערות מועילות על כתב היד. החומר זה מבוסס על העבודה הנתמכת בחלקו על ידי מדינת קונטיקט במסגרת התכנית לקונטיקט לתאי הגזע למחקר המענקים. התוכן שלה הוא באחריות בלעדית של הכותבים ואינם מייצג בהכרח את עמדתה הרשמית של מדינת קונטיקט, המחלקה לבריאות ציבור של מדינת קונטיקט או CT חידושים, Incorporated.
Materials
| Solute | Company | Catalog Number | Dissection (mM) |
| Sucrose | Sigma | S0389 | Dissection: 147 mM ACSF: 0 mM |
| NaCl | Sigma | S9888 | Dissection: 42 mM ACSF: 126 mM |
| KCl | Sigma | P3911 | Dissection: 2.5 mM ACSF: 2.5 mM |
| MgCl2.6H2O | Sigma | M9272 | Dissection: 4.33 mM ACSF: 1 mM |
| NaH2PO4.H2O | Sigma | S8282 | Dissection: 1.25 mM ACSF: 1.25 mM |
| Glucose | Sigma | G8270 | Dissection: 10 mM ACSF: 10 mM |
| NaHCO3 | Sigma | S6014 | Dissection: 26 mM ACSF: 26 mM |
| CaCl2.2H2O | Sigma | C3306 | Dissection: 1.33 mM ACSF: 2 mM |
Table 1. Chemical list and recipes of dissection solution and ACSF.
| [header] | |||
| Name | Company | Catalogue Number | Comments |
| Vibratome | Leica | VT 1000S | |
| Super Glue | Surehold or 3M | Surehold 3G Super Glue or 3M Vet-Bond | |
| Dissection tools | Roboz or Ted Pella | ||
| Fluo-4 AM calcium-sensitive dye | Invitrogen | F14201 | |
| Oregon Green BAPTA-1 AM calcium-sensitive dye | Invitrogen | O6807 | |
| Pluronic F-127 20% solution in DMSO | Invitrogen | P3000MP | |
| Upright confocal microscope | Olympus | FV300 or FV1000 | |
| Water-immersion objectives | Olympus | LUMPlanFl 40 x W/IR (NA 0.80); LUMPlanFl 60 x W/I (NA 0.90) | |
| Micromanipulators | Sutter | MPC-200/MPC-325/MPC-385 | |
| Pressure controller | Parker Hannifin | Picospritzer | <3 PSI during application |
| Pipette puller | Sutter or Narshige | Sutter P-97 or Narshige PP-830 | |
| Glass pipettes | Sutter | BF150-110-10 | I.D.:1.10, O.D.: 1.50 |
| Peristaltic pump | Harvard Apparatus | Model 720 | flow rate: 1 ml/min |
| Chamber bath | Warner Instruments | RC-26 GLP | Low profile allows for objective clearance |
| Tubing | Tygon | ||
| Temperature Controller | Warner Instruments | TC-324B/344B |
Table 2. Materials/equipment list.
References
- Peretto, P., Giachino, C., Aimar, P., Fasolo, A., Bonfanti, L. Chain formation and glial tube assembly in the shift from neonatal to adult subventricular zone of the rodent forebrain. J. Comp Neurol. 487, 407-427 (2005).
- Lacar, B., Young, S. Z., Platel, J. C., Bordey, A. Imaging and recording subventricular zone progenitor cells in live tissue of postnatal mice. Front. Neurosci. 4, 10-3389 (2010).
- Lacar, B., Young, S. Z., Platel, J. C., Bordey, A. Gap junction-mediated calcium waves define communication networks among murine postnatal neural progenitor cells. Eur. J. Neurosci. , (2011).
- Platel, J. C., Dave, K. A., Gordon, V., Lacar, B., Rubio, M. E., Bordey, A. NMDA receptors activated by subventricular zone astrocytic glutamate are critical for neuroblast survival prior to entering a synaptic network. Neuron. 65, 859-872 (2010).
- Platel, J. C., Dupuis, A., Boisseau, S., Villaz, M., Albrieux, M., Brocard, J. Synchrony of spontaneous calcium activity in mouse neocortex before synaptogenesis. Eur. J. Neurosci. 25, 920-928 (2007).
- Young, S. Z., Platel, J. C., Nielsen, J. V., Jensen, N. A., Bordey, A. GABAA increases calcium in subventricular zone astrocyte-like cells through L- and T-type voltage-gated calcium channels. Front. Cell. Neurosci. 4, 8 (2010).
- Bolteus, A. J., Bordey, A. GABA Release and Uptake Regulate Neuronal Precursor Migration in the Postnatal Subventricular Zone. J. Neurosci. 24, 7623-7631 (2004).
- Platel, J., Heintz, T., Young, S., Gordon, V., Bordey, A. Tonic activation of GLUK5 kainate receptors decreases neuroblast migration in a whole mount preparation of the subventricular zone. J. Physiol. (Lond). 586, 3783-3793 (2008).
- Nam, S. C., Kim, Y., Dryanovski, D., Walker, A., Goings, G., Woolfrey, K., Kang, S. S., Chu, C., Chenn, A., Erdelyi, F., Szabo, G., Hockberger, P., Szele, F. G. Dynamic features of postnatal subventricular zone cell motility: a two-photon time-lapse study. J. Comp. Neurol. 505, 190-208 (2007).
- Lacar, B. L., Platel, J. C., Bordey, A. GABA controls Ca2+ activity-dependent network synchrony in the adult neurogenic forebrain. , (2007).
- Liu, X., Bolteus, A. J., Balkin, D. M., Henschel, O., Bordey, A. GFAP-expressing cells in the postnatal subventricular zone display a unique glial phenotype intermediate between radial glia and astrocytes. Glia. 54, 394-410 (2006).
- Wang, D. D., Krueger, D. D., Bordey, A. Biophysical properties and ionic signature of neuronal progenitors of the postnatal subventricular zone in situ. J. Neurophysiol. 90, 2291-2302 (2003).
- Tian, L., Hires, S. A., Mao, T., Huber, D., Chiappe, M. E., Chalasani, S. H., Petreanu, L., Akerboom, J., McKinney, S. A., Schreiter, E. R., Bargmann, C. I., Jayaraman, V., Svoboda, K., Looger, L. L. Imaging neural activity in worms, flies and mice with improved GCaMP calcium indicators. Nat. Methods. 6, 875-881 (2009).
- Zhao, Y., Araki, S., Wu, J., Teramoto, T., Chang, Y. F. An expanded palette of genetically encoded Ca(2) indicators. Science. 333, 1888-1891 (2011).
- Shigetomi, E., Kracun, S., Sofroniew, M. V., Khakh, B. S. A genetically targeted optical sensor to monitor calcium signals in astrocyte processes. Nat. Neurosci. 13, 759-766 (2010).
