إعداد شرائح الحاد المنطقة Subventricular للتصوير الكالسيوم
Summary
ووصف طريقة لتحميل subventricular منطقة (SVZ) الخلايا مع الأصباغ الكالسيوم مؤشر لنشاط الكالسيوم التسجيل. وSVZ بعد الولادة يحتوي على خلايا معبأة بإحكام بما في ذلك الخلايا العصبية والسلف neuroblasts. بدلا من استخدام حمام التحميل حقن الصبغة عن طريق فإننا الضغط داخل الأنسجة مما يسمح نشر أفضل صباغة.
Abstract
منطقة subventricular (SVZ) هي واحدة من المنطقتين العصبية في الدماغ بعد الولادة. ويحتوي على خلايا SVZ المزدحمة بالسكان، بما في ذلك الخلايا العصبية السلف مع ميزات نجمي (وتسمى الخلايا النجمية SVZ)، neuroblasts، والخلايا الاولية وسيطة. Neuroblasts ولد في SVZ ترحيل عرضية مسافة كبيرة على البصلة الشمية، حيث أنها تفرق في interneurons. إشارات بين الخلايا من خلال جزيئات الالتصاق وإشارات إنتشاري تلعب أدوارا هامة في تكوين الخلايا العصبية مسيطرة. كثير من هذه الإشارات بين الخلايا يؤدي النشاط الكالسيوم التي تنقل المعلومات داخل وبين الخلايا. النشاط الكالسيوم وبالتالي هو انعكاس لنشاط خارج الخلية إشارات وهي الطريقة المثلى لفهم الإشارات بين الخلايا الوظيفية بين خلايا SVZ.
وقد تمت دراسة نشاط الكالسيوم في العديد من المناطق الأخرى وأنواع الخلايا، بما في ذلك الخلايا النجمية والخلايا العصبية الناضجة. ومع ذلك، فإن الطريقة التقليدية لمبناهاكان د مع الكالسيوم خلايا الصبغة مؤشر (أي تحميل حمام) ليست فعالة في تحميل جميع أنواع الخلايا SVZ. والواقع أن الكثافة الخلوية في SVZ يمنع نشر الصبغة داخل الأنسجة. وبالإضافة إلى ذلك، سوف إعداد شرائح سهمي الحفاظ على أفضل ترتيب ثلاثي الأبعاد من الخلايا SVZ، ولا سيما تيار الهجرة أرومة عصبية على المحور منقاري-الذيلية.
هنا، نحن تصف طرق لإعداد أقسام السهمي الذي يحتوي على SVZ، التحميل من خلايا الصبغة SVZ مع مؤشر الكالسيوم، واكتساب النشاط الكالسيوم مع مرور الزمن الأفلام. كنا فلوو-04:00 صبغ الخلايا النجمية لتحميل التطبيق الخاص SVZ الضغط داخل الأنسجة. تم تسجيل النشاط الكالسيوم باستخدام مجهر المسح مبائر يسمح قرار دقيقة لتمييز الخلايا الفردية. نهجنا ينطبق على مناطق أخرى العصبية بما في ذلك منطقة قرن آمون والكبار جزئي التحبب المناطق العصبية الجنينية. وبالإضافة إلى ذلك، يمكن لأنواع أخرى من الأصباغأن يطبق باستخدام الطريقة الموصوفة.
Protocol
Discussion
وقد استخدم التصوير الكالسيوم من الخلايا لدراسة أنماط SVZ في النشاط العفوي في neuroblasts 10، مستقبلات التعبير في كل من قناة neuroblasts والخلايا النجمية وموجات 4،6،8 الكالسيوم نجمي 3. منذ الخلايا في SVZ هي غير ناضجة أو لها خصائص الدبقية، فإنها لا تطلق الإمكانيات …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وأيد هذا العمل من المنح المقدمة من المعاهد الوطنية للصحة (DC007681، AB)، CT الخلايا الجذعية منحة (AB)، باردي الأساس (AB)، Predoctoral روث L. كيرشتاين القومي للبحوث الخدمة الجوائز (NRSA) (SZY)، ودراسات عليا أبحاث NSF الزمالة (BL). نشكر أعضاء مختبر Bordey للتعليقات مفيدة على المخطوطة. ويستند المواد الحالية على العمل المدعوم جزئيا من ولاية كونيتيكت تحت الخلايا الجذعية كونيتيكت برنامج المنح البحثية. محتوياته هي الجهة الوحيدة المسؤولة عن أصحابها ولا تعبر بالضرورة عن وجهات النظر الرسمية للدولة من ولاية كونيتيكت، وزارة الصحة العامة في دولة الابتكارات كونيتيكت أو CT، إعلام.
Materials
| Solute | Company | Catalog Number | Dissection (mM) |
| Sucrose | Sigma | S0389 | Dissection: 147 mM ACSF: 0 mM |
| NaCl | Sigma | S9888 | Dissection: 42 mM ACSF: 126 mM |
| KCl | Sigma | P3911 | Dissection: 2.5 mM ACSF: 2.5 mM |
| MgCl2.6H2O | Sigma | M9272 | Dissection: 4.33 mM ACSF: 1 mM |
| NaH2PO4.H2O | Sigma | S8282 | Dissection: 1.25 mM ACSF: 1.25 mM |
| Glucose | Sigma | G8270 | Dissection: 10 mM ACSF: 10 mM |
| NaHCO3 | Sigma | S6014 | Dissection: 26 mM ACSF: 26 mM |
| CaCl2.2H2O | Sigma | C3306 | Dissection: 1.33 mM ACSF: 2 mM |
Table 1. Chemical list and recipes of dissection solution and ACSF.
| [header] | |||
| Name | Company | Catalogue Number | Comments |
| Vibratome | Leica | VT 1000S | |
| Super Glue | Surehold or 3M | Surehold 3G Super Glue or 3M Vet-Bond | |
| Dissection tools | Roboz or Ted Pella | ||
| Fluo-4 AM calcium-sensitive dye | Invitrogen | F14201 | |
| Oregon Green BAPTA-1 AM calcium-sensitive dye | Invitrogen | O6807 | |
| Pluronic F-127 20% solution in DMSO | Invitrogen | P3000MP | |
| Upright confocal microscope | Olympus | FV300 or FV1000 | |
| Water-immersion objectives | Olympus | LUMPlanFl 40 x W/IR (NA 0.80); LUMPlanFl 60 x W/I (NA 0.90) | |
| Micromanipulators | Sutter | MPC-200/MPC-325/MPC-385 | |
| Pressure controller | Parker Hannifin | Picospritzer | <3 PSI during application |
| Pipette puller | Sutter or Narshige | Sutter P-97 or Narshige PP-830 | |
| Glass pipettes | Sutter | BF150-110-10 | I.D.:1.10, O.D.: 1.50 |
| Peristaltic pump | Harvard Apparatus | Model 720 | flow rate: 1 ml/min |
| Chamber bath | Warner Instruments | RC-26 GLP | Low profile allows for objective clearance |
| Tubing | Tygon | ||
| Temperature Controller | Warner Instruments | TC-324B/344B |
Table 2. Materials/equipment list.
References
- Peretto, P., Giachino, C., Aimar, P., Fasolo, A., Bonfanti, L. Chain formation and glial tube assembly in the shift from neonatal to adult subventricular zone of the rodent forebrain. J. Comp Neurol. 487, 407-427 (2005).
- Lacar, B., Young, S. Z., Platel, J. C., Bordey, A. Imaging and recording subventricular zone progenitor cells in live tissue of postnatal mice. Front. Neurosci. 4, 10-3389 (2010).
- Lacar, B., Young, S. Z., Platel, J. C., Bordey, A. Gap junction-mediated calcium waves define communication networks among murine postnatal neural progenitor cells. Eur. J. Neurosci. , (2011).
- Platel, J. C., Dave, K. A., Gordon, V., Lacar, B., Rubio, M. E., Bordey, A. NMDA receptors activated by subventricular zone astrocytic glutamate are critical for neuroblast survival prior to entering a synaptic network. Neuron. 65, 859-872 (2010).
- Platel, J. C., Dupuis, A., Boisseau, S., Villaz, M., Albrieux, M., Brocard, J. Synchrony of spontaneous calcium activity in mouse neocortex before synaptogenesis. Eur. J. Neurosci. 25, 920-928 (2007).
- Young, S. Z., Platel, J. C., Nielsen, J. V., Jensen, N. A., Bordey, A. GABAA increases calcium in subventricular zone astrocyte-like cells through L- and T-type voltage-gated calcium channels. Front. Cell. Neurosci. 4, 8 (2010).
- Bolteus, A. J., Bordey, A. GABA Release and Uptake Regulate Neuronal Precursor Migration in the Postnatal Subventricular Zone. J. Neurosci. 24, 7623-7631 (2004).
- Platel, J., Heintz, T., Young, S., Gordon, V., Bordey, A. Tonic activation of GLUK5 kainate receptors decreases neuroblast migration in a whole mount preparation of the subventricular zone. J. Physiol. (Lond). 586, 3783-3793 (2008).
- Nam, S. C., Kim, Y., Dryanovski, D., Walker, A., Goings, G., Woolfrey, K., Kang, S. S., Chu, C., Chenn, A., Erdelyi, F., Szabo, G., Hockberger, P., Szele, F. G. Dynamic features of postnatal subventricular zone cell motility: a two-photon time-lapse study. J. Comp. Neurol. 505, 190-208 (2007).
- Lacar, B. L., Platel, J. C., Bordey, A. GABA controls Ca2+ activity-dependent network synchrony in the adult neurogenic forebrain. , (2007).
- Liu, X., Bolteus, A. J., Balkin, D. M., Henschel, O., Bordey, A. GFAP-expressing cells in the postnatal subventricular zone display a unique glial phenotype intermediate between radial glia and astrocytes. Glia. 54, 394-410 (2006).
- Wang, D. D., Krueger, D. D., Bordey, A. Biophysical properties and ionic signature of neuronal progenitors of the postnatal subventricular zone in situ. J. Neurophysiol. 90, 2291-2302 (2003).
- Tian, L., Hires, S. A., Mao, T., Huber, D., Chiappe, M. E., Chalasani, S. H., Petreanu, L., Akerboom, J., McKinney, S. A., Schreiter, E. R., Bargmann, C. I., Jayaraman, V., Svoboda, K., Looger, L. L. Imaging neural activity in worms, flies and mice with improved GCaMP calcium indicators. Nat. Methods. 6, 875-881 (2009).
- Zhao, Y., Araki, S., Wu, J., Teramoto, T., Chang, Y. F. An expanded palette of genetically encoded Ca(2) indicators. Science. 333, 1888-1891 (2011).
- Shigetomi, E., Kracun, S., Sofroniew, M. V., Khakh, B. S. A genetically targeted optical sensor to monitor calcium signals in astrocyte processes. Nat. Neurosci. 13, 759-766 (2010).
