Preparação de fatias agudas zona subventricular for Imaging Cálcio
Summary
Um método para carregar subventricular zona (SVZ) de células com corantes de cálcio indicador de actividade de cálcio gravação é descrito. A SVZ pós-natal contém células hermeticamente embalados, incluindo as células progenitoras neurais e neuroblastos. Ao invés de usar o carregamento banho foi injetado o corante por pressão dentro do tecido, permitindo uma melhor difusão de corante.
Abstract
A zona subventricular (SVZ) é uma das duas zonas de origem neural no cérebro pós-natal. A SVZ contém células densamente, incluindo as células progenitoras neurais com características astrocíticos (chamados astrócitos SVZ), neuroblastos e células progenitoras intermediárias. Neuroblastos nascidos no SVZ tangencialmente migrar uma grande distância para o bulbo olfativo, onde se diferenciam em interneurônios. Sinalização através de moléculas de adesão intercelular e sinais difusíveis desempenham papéis importantes na neurogênese de controle. Muitos destes sinais de desencadear a actividade do cálcio intercelular, que transmite a informação dentro e entre as células. Actividade de cálcio é, portanto, reflexo da actividade de sinais extracelulares e é uma forma optimizada para compreender sinalização intercelular entre as células SVZ funcional.
Actividade de cálcio foi estudada em diversas outras regiões e tipos de células, incluindo os astrócitos maduros e os neurónios. No entanto, o método tradicional de loacélulas D com cálcio indicador corante (ou seja, carga banho) não foi eficiente no carregamento de todos os tipos de células SVZ. De facto, a densidade celular no SVZ impede a difusão do corante dentro do tecido. Além disso, a preparação de cortes sagitais será melhor preservar o arranjo tridimensional de culas SVZ, particularmente o fluxo de migração dos neuroblastos no eixo rostral-caudal.
Aqui, descrevemos métodos para preparar secções sagitais contendo o SVZ, o carregamento de culas SVZ com corante indicador de cálcio, e a aquisição da actividade de cálcio com lapso de tempo a filmes. Utilizou-Fluo-04:00 corante de carregamento astrócitos SVZ usando a aplicação de pressão no interior do tecido. Atividade de cálcio foi gravado utilizando um microscópio de varredura confocal permitindo uma resolução precisa para distinguir células individuais. A nossa abordagem é aplicável a outras zonas de origem neural, incluindo a zona do hipocampo adulto subgranular embrionárias e as zonas de origem neural. Além disso, outros tipos de corantes podeser aplicado utilizando o método descrito.
Protocol
Discussion
Imagiologia de cálcio de células SVZ tem sido utilizada para estudar os padrões de actividade espontânea em 10 neuroblastos, expressão de receptores de canal em ambos os neuroblastos e astrócitos 4,6,8 e ondas de cálcio astrocíticos 3. Uma vez que as células no SVZ ou são imaturos ou têm propriedades gliais, eles não são acionados acção potenciais 11,12, o que significa que alterações no potencial de voltagem milissegundo indicativos de actividade em redes mad…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho foi suportado por concessões do NIH (DC007681, AB), Caule CT celular concessão (AB), fundação Pardee (AB), predoctoral Ruth L. Kirschstein Nacional de Pesquisa Serviço de Prêmios (NRSA) (SZY), e um NSF Graduate Research Fellowship (BL). Agradecemos aos membros do laboratório Bordey pelos comentários úteis sobre o manuscrito. O presente material é baseado em trabalho, em parte suportado pelo Estado de Connecticut sob o Stem Cell Research Connecticut Programa de Subsídios. Seu conteúdo é de responsabilidade exclusiva dos autores e não representam necessariamente a posição oficial do Estado de Connecticut, o Departamento de Saúde Pública do Estado de Connecticut ou CT Innovations, Incorporated.
Materials
| Solute | Company | Catalog Number | Dissection (mM) |
| Sucrose | Sigma | S0389 | Dissection: 147 mM ACSF: 0 mM |
| NaCl | Sigma | S9888 | Dissection: 42 mM ACSF: 126 mM |
| KCl | Sigma | P3911 | Dissection: 2.5 mM ACSF: 2.5 mM |
| MgCl2.6H2O | Sigma | M9272 | Dissection: 4.33 mM ACSF: 1 mM |
| NaH2PO4.H2O | Sigma | S8282 | Dissection: 1.25 mM ACSF: 1.25 mM |
| Glucose | Sigma | G8270 | Dissection: 10 mM ACSF: 10 mM |
| NaHCO3 | Sigma | S6014 | Dissection: 26 mM ACSF: 26 mM |
| CaCl2.2H2O | Sigma | C3306 | Dissection: 1.33 mM ACSF: 2 mM |
Table 1. Chemical list and recipes of dissection solution and ACSF.
| [header] | |||
| Name | Company | Catalogue Number | Comments |
| Vibratome | Leica | VT 1000S | |
| Super Glue | Surehold or 3M | Surehold 3G Super Glue or 3M Vet-Bond | |
| Dissection tools | Roboz or Ted Pella | ||
| Fluo-4 AM calcium-sensitive dye | Invitrogen | F14201 | |
| Oregon Green BAPTA-1 AM calcium-sensitive dye | Invitrogen | O6807 | |
| Pluronic F-127 20% solution in DMSO | Invitrogen | P3000MP | |
| Upright confocal microscope | Olympus | FV300 or FV1000 | |
| Water-immersion objectives | Olympus | LUMPlanFl 40 x W/IR (NA 0.80); LUMPlanFl 60 x W/I (NA 0.90) | |
| Micromanipulators | Sutter | MPC-200/MPC-325/MPC-385 | |
| Pressure controller | Parker Hannifin | Picospritzer | <3 PSI during application |
| Pipette puller | Sutter or Narshige | Sutter P-97 or Narshige PP-830 | |
| Glass pipettes | Sutter | BF150-110-10 | I.D.:1.10, O.D.: 1.50 |
| Peristaltic pump | Harvard Apparatus | Model 720 | flow rate: 1 ml/min |
| Chamber bath | Warner Instruments | RC-26 GLP | Low profile allows for objective clearance |
| Tubing | Tygon | ||
| Temperature Controller | Warner Instruments | TC-324B/344B |
Table 2. Materials/equipment list.
References
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