Beredning av akut subventrikulära zonen Skivor för kalcium Imaging
Summary
En metod för att ladda subventrikulära zonen (SVZ) celler med färgämnen kalcium Indikator för inspelning kalcium aktivitet beskrivs. Den postnatala SVZ innehåller tätt packade celler, inklusive neurala stamceller och neuroblaster. Istället för att använda bad belastning vi injicerade färgen genom trycket i vävnaden möjliggör bättre färg diffusion.
Abstract
Den subventrikulära zonen (SVZ) är en av de två neurogena zonerna i postnatala hjärnan. I SVZ innehåller tätt packade celler, inklusive neurala stamceller med astrocytiska funktioner (kallas SVZ astrocyter), neuroblaster, och mellanliggande progenitorceller. Neuroblaster födda i SVZ migrera tangentiellt ett stort avstånd till luktloben, där de differentierar till interneuronen. Intercellulära signalering via adhesionsmolekyler och diffunderbara signaler spelar en viktig roll i kontrollen neurogenes. Många av dessa signaler utlösa intercellulära kalcium aktivitet som sänder information inom och mellan celler. Kalcium aktivitet är således återspeglar aktiviteten hos extracellulära signaler och är ett optimalt sätt att förstå funktionella intercellulär signalering mellan SVZ celler.
Kalcium aktivitet har studerats i många andra regioner och celltyper, inklusive mogna astrocyter och nervceller. Men den traditionella metoden till load celler med kalcium-indikatorfärgämne (dvs. bad belastning) var inte effektiva vid lastning alla SVZ celltyper. Faktiskt hindrar cellulär densitet i SVZ färgdiffusion inuti vävnaden. Dessutom kommer förbereda sagittala skivor bättre bevara den tredimensionella arrangemanget av SVZ celler, särskilt strömmen av neuroblast migration på rostral-caudal axeln.
Här beskriver vi metoder för att förbereda sagittala sektioner innehållande SVZ, lastning av SVZ celler med kalcium indikatorfärgämne, och förvärvet av kalcium aktivitet med time-lapse-filmer. Vi använde Fluo-4:00 färg för lastning SVZ astrocyter med tryck ansökan inne i vävnaden. Kalcium aktiviteten registrerades med hjälp av en scanning konfokalmikroskop tillåter en exakt upplösning för särskiljande enskilda celler. Vår strategi är tillämplig på andra neurogena zoner, inklusive den vuxna hippocampus subgranular zon och embryonala neurogena zoner. Dessutom kan andra typer av färgämnen kanappliceras med användning av den beskrivna metoden.
Protocol
Discussion
Kalcium avbildning av SVZ celler har använts för att studera mönster i spontan aktivitet i 10 neuroblaster, receptorkanalen uttryck i både neuroblaster och astrocyter 4,6,8 och astrocytiska vågor kalcium 3. Eftersom celler i SVZ är antingen omogna eller har gliaceller egenskaper, inte sparka de inte aktionspotentialer 11,12, vilket innebär att millisekund förändringar i spänningspotential indikerar aktivitet i mogna nätverk är inte tillämplig i detta område. Där…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta arbete har finansierats med bidrag från NIH (DC007681, AB), CT Stem Cell bidrag (AB), Pardee stiftelse (AB), Predoctoral Ruth L. Kirschstein National Research Service Awards (NRSA) (SZY) och en NSF Graduate Research gemenskap (BL). Vi tackar Bordey labbet medlemmar för värdefulla kommentarer på manuskriptet. Den nuvarande materialet bygger på arbete delvis stöds av staten Connecticut under Connecticut stamcellsforskning Grants. Dess innehåll är helt och hållet av författarna och inte nödvändigtvis representerar officiella ståndpunkter i staten Connecticut, Institutionen för folkhälsovetenskap i delstaten Connecticut eller CT Innovations, Incorporated.
Materials
| Solute | Company | Catalog Number | Dissection (mM) |
| Sucrose | Sigma | S0389 | Dissection: 147 mM ACSF: 0 mM |
| NaCl | Sigma | S9888 | Dissection: 42 mM ACSF: 126 mM |
| KCl | Sigma | P3911 | Dissection: 2.5 mM ACSF: 2.5 mM |
| MgCl2.6H2O | Sigma | M9272 | Dissection: 4.33 mM ACSF: 1 mM |
| NaH2PO4.H2O | Sigma | S8282 | Dissection: 1.25 mM ACSF: 1.25 mM |
| Glucose | Sigma | G8270 | Dissection: 10 mM ACSF: 10 mM |
| NaHCO3 | Sigma | S6014 | Dissection: 26 mM ACSF: 26 mM |
| CaCl2.2H2O | Sigma | C3306 | Dissection: 1.33 mM ACSF: 2 mM |
Table 1. Chemical list and recipes of dissection solution and ACSF.
| [header] | |||
| Name | Company | Catalogue Number | Comments |
| Vibratome | Leica | VT 1000S | |
| Super Glue | Surehold or 3M | Surehold 3G Super Glue or 3M Vet-Bond | |
| Dissection tools | Roboz or Ted Pella | ||
| Fluo-4 AM calcium-sensitive dye | Invitrogen | F14201 | |
| Oregon Green BAPTA-1 AM calcium-sensitive dye | Invitrogen | O6807 | |
| Pluronic F-127 20% solution in DMSO | Invitrogen | P3000MP | |
| Upright confocal microscope | Olympus | FV300 or FV1000 | |
| Water-immersion objectives | Olympus | LUMPlanFl 40 x W/IR (NA 0.80); LUMPlanFl 60 x W/I (NA 0.90) | |
| Micromanipulators | Sutter | MPC-200/MPC-325/MPC-385 | |
| Pressure controller | Parker Hannifin | Picospritzer | <3 PSI during application |
| Pipette puller | Sutter or Narshige | Sutter P-97 or Narshige PP-830 | |
| Glass pipettes | Sutter | BF150-110-10 | I.D.:1.10, O.D.: 1.50 |
| Peristaltic pump | Harvard Apparatus | Model 720 | flow rate: 1 ml/min |
| Chamber bath | Warner Instruments | RC-26 GLP | Low profile allows for objective clearance |
| Tubing | Tygon | ||
| Temperature Controller | Warner Instruments | TC-324B/344B |
Table 2. Materials/equipment list.
References
- Peretto, P., Giachino, C., Aimar, P., Fasolo, A., Bonfanti, L. Chain formation and glial tube assembly in the shift from neonatal to adult subventricular zone of the rodent forebrain. J. Comp Neurol. 487, 407-427 (2005).
- Lacar, B., Young, S. Z., Platel, J. C., Bordey, A. Imaging and recording subventricular zone progenitor cells in live tissue of postnatal mice. Front. Neurosci. 4, 10-3389 (2010).
- Lacar, B., Young, S. Z., Platel, J. C., Bordey, A. Gap junction-mediated calcium waves define communication networks among murine postnatal neural progenitor cells. Eur. J. Neurosci. , (2011).
- Platel, J. C., Dave, K. A., Gordon, V., Lacar, B., Rubio, M. E., Bordey, A. NMDA receptors activated by subventricular zone astrocytic glutamate are critical for neuroblast survival prior to entering a synaptic network. Neuron. 65, 859-872 (2010).
- Platel, J. C., Dupuis, A., Boisseau, S., Villaz, M., Albrieux, M., Brocard, J. Synchrony of spontaneous calcium activity in mouse neocortex before synaptogenesis. Eur. J. Neurosci. 25, 920-928 (2007).
- Young, S. Z., Platel, J. C., Nielsen, J. V., Jensen, N. A., Bordey, A. GABAA increases calcium in subventricular zone astrocyte-like cells through L- and T-type voltage-gated calcium channels. Front. Cell. Neurosci. 4, 8 (2010).
- Bolteus, A. J., Bordey, A. GABA Release and Uptake Regulate Neuronal Precursor Migration in the Postnatal Subventricular Zone. J. Neurosci. 24, 7623-7631 (2004).
- Platel, J., Heintz, T., Young, S., Gordon, V., Bordey, A. Tonic activation of GLUK5 kainate receptors decreases neuroblast migration in a whole mount preparation of the subventricular zone. J. Physiol. (Lond). 586, 3783-3793 (2008).
- Nam, S. C., Kim, Y., Dryanovski, D., Walker, A., Goings, G., Woolfrey, K., Kang, S. S., Chu, C., Chenn, A., Erdelyi, F., Szabo, G., Hockberger, P., Szele, F. G. Dynamic features of postnatal subventricular zone cell motility: a two-photon time-lapse study. J. Comp. Neurol. 505, 190-208 (2007).
- Lacar, B. L., Platel, J. C., Bordey, A. GABA controls Ca2+ activity-dependent network synchrony in the adult neurogenic forebrain. , (2007).
- Liu, X., Bolteus, A. J., Balkin, D. M., Henschel, O., Bordey, A. GFAP-expressing cells in the postnatal subventricular zone display a unique glial phenotype intermediate between radial glia and astrocytes. Glia. 54, 394-410 (2006).
- Wang, D. D., Krueger, D. D., Bordey, A. Biophysical properties and ionic signature of neuronal progenitors of the postnatal subventricular zone in situ. J. Neurophysiol. 90, 2291-2302 (2003).
- Tian, L., Hires, S. A., Mao, T., Huber, D., Chiappe, M. E., Chalasani, S. H., Petreanu, L., Akerboom, J., McKinney, S. A., Schreiter, E. R., Bargmann, C. I., Jayaraman, V., Svoboda, K., Looger, L. L. Imaging neural activity in worms, flies and mice with improved GCaMP calcium indicators. Nat. Methods. 6, 875-881 (2009).
- Zhao, Y., Araki, S., Wu, J., Teramoto, T., Chang, Y. F. An expanded palette of genetically encoded Ca(2) indicators. Science. 333, 1888-1891 (2011).
- Shigetomi, E., Kracun, S., Sofroniew, M. V., Khakh, B. S. A genetically targeted optical sensor to monitor calcium signals in astrocyte processes. Nat. Neurosci. 13, 759-766 (2010).
