एकल कोशिका के जीन प्रतिलेखन की शाही सेना प्रतिदीप्त द्वारा विश्लेषण<em> स्वस्थानी</em> संकरण (मछली)
Summary
प्रतिदीप्ति<em> स्वस्थानी में</em> संकरण (मछली) के एक से अधिक सदस्य के साथ – साथ ट्रांसक्रिप्शन के रूप में करने के लिए व्यक्ति की कोशिकाओं में mRNA टेप की पहचान में polygenic गतिविधि के विश्लेषण की अनुमति देता है<em> Var</em> बहुजीनीय परिवार में<em> प्लाज्मोडियम फाल्सीपेरम</em> संक्रमित एरिथ्रोसाइट्स<sup> 1</sup>. तकनीक के अनुकूल है और जीन कोशिकाओं और जीवों की विभिन्न प्रकार पर इस्तेमाल किया जा सकता है.
Abstract
प्लाज्मोडियम फाल्सीपेरम मानव endothelial रिसेप्टर्स करने के लिए संक्रमित (आईई) मलेरिया के संक्रमण के दौरान एरिथ्रोसाइट्स के आसंजन PfEMP1 var जीन द्वारा इनकोडिंग प्रोटीन वेरिएंट की अभिव्यक्ति द्वारा मध्यस्थता है.
अगुणित पी. फाल्सीपेरम जीनोम लगभग 60 विभिन्न var जीन जिनमें से केवल एक सेल प्रति एक समय में संक्रमण के रक्त चरण के दौरान लिखित माना गया है harbors. Var जीन प्रतिलेखन के ऐसे परस्पर अनन्य विनियमन कैसे हासिल की है यह स्पष्ट नहीं है, के रूप में व्यक्तिगत var जीन या var अलग पी. के नैदानिक परिणाम पर और अंतर बाध्यकारी परिणाम रिसेप्टर्स के साथ जुड़े जीन की उप समूहों की पहचान है फाल्सीपेरम संक्रमण. हाल ही में, परस्पर अनन्य ट्रांसक्रिप्शन प्रतिमान प्रतिलेखन व्यक्ति पी. पर आधारित assays द्वारा किया गया है संदेह में बुलाया फाल्सीपेरम एकल inf में प्रतिलिपि पहचानपी. की व्यक्तिगत नाभिक में परजीवी द्वारा ected एरिथ्रोसाइटिक स्वस्थानी संकरण में शाही सेना फ्लोरोसेंट का उपयोग कोशिकाओं (मछली) var जीन प्रतिलेखन के विश्लेषण फाल्सीपेरम IE 1.
यहाँ, हम बाहर पी. के एकल नाभिक में शाही सेना मछली पद्धति ले जाने लिए var जीन प्रतिलेखन के विश्लेषण के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल उपस्थित फाल्सीपेरम मानव एरिथ्रोसाइट्स संक्रमित. विधि के प्रयोग पर आधारित है digoxigenin और antisense शाही सेना जांच TSA प्लस प्रतिदीप्ति पैलेट 2 प्रणाली (Perkin एल्मर), सूक्ष्म विश्लेषण और हौसले से चयनित पी. बायोटिन लेबल फाल्सीपेरम IE. स्वस्थानी संकरण विधि में पी. के विभिन्न चरणों के दौरान व्यक्त प्रतिलेखन और जीन की एक किस्म के विनियमन पर नजर रखने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है फाल्सीपेरम जीवन और चक्र अन्य मलेरिया परजीवी प्रजातियों और अन्य जीवों और सेल प्रकार के लिए अनुकूल है.
Protocol
Representative Results
Discussion
आरएनए मछली विश्लेषण, उत्तरी सोख्ता और RT-पीसीआर के रूप में इस तरह के तरीकों के विपरीत, विशिष्ट mRNA टेप के एकल कोशिका के स्तर पर भेदभाव की अनुमति देता है. यह transcriptionally सक्रिय और निष्क्रिय कोशिकाओं के बीच भेदभाव …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
लेखकों के लिए उत्कृष्ट तकनीकी सहायता के लिए परजीवी और क्रिस्टीना होल्म जीनोटाइपिंग के लिए धन्यवाद देना चाहूंगा माइकल Alifrangis और उल्ला Abildtrup. इस काम हॉवर्ड ह्यूजेस मेडिकल संस्थान (55005511 अनुदान), लंडबेक फाउंडेशन (अनुदान R9-A840) और नील्स बोह्र फाउंडेशन द्वारा वित्त पोषित किया गया था.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
| Acetic Acid | Sigma/Aldrich | 338826-100ml | |
| Albumax media: RPMI 1640 Glutamine solution | Lonza | BE12-115F | 500 ml RPMI 1640
5 ml glutamine solution |
| Albumax media: Gentamycin sulphate Albumax-solution | Lonza | BE02-012E | 2.5 ml gentamycin sulphate
50 ml Albumax-solution |
| Albumax-solution: Hypoxanthine | Sigma-Aldrich | H9377 | 0.8 g Hypoxanthine |
| Albumax-solution: AlbuMAX II | Invitrogen | 11021-037 | 200 g Albumax |
| Albumax-solution: RPMI 1640 | Lonza | BE12-115F | 4 liter RPMI 1640
Dissolve with magnet at max. 50 °C. Filter sterilize and store at -20 °C in aliquots. |
| Amberlite | Sigma | A5710-110G | Resin to deionize formamide. |
| Anti-biotin goat pAb Peroxidase Conjugate | Calbiochem | 203206 | |
| Anti-Dig antibody | Novus biologicals | NB100-41330 | |
| Anti-fade reagent with DAPI | Invitrogen | P36931 | The mounting media has to cure for 24 hr before sealing the slide completely. |
| Biotin RNA Labeling Mix | Roche | 11685597910 | |
| Camera digital | Nikon digital sight DC-F11 | ||
| Coverslips | Menzel-glaser | 631-1570 | |
| culture flask 25 cm2 Nunclon surface | Nunc | 156340 | |
| DEPC | Fluka/Sigma | 32490-100ml | 1 ml DEPC in 1000 ml deinonized water. Add a stir bar and stir for 12 hr. Autoclave for 30 min. |
| Digital camera | Nikon digital sight DC-F11 | ||
| Dynabeads Protein A | Invitrogen | 10002D | |
| DynaMaq-15 Magnet | Invitrogen | 123-01D | |
| Formamide bioultra 99 % | Fluka/Sigma | 47671-1l-F | Deionized formamide: 5 g of ion exchange resin per 100 ml of formamide. Stir 30 min. Filter through Whatman paper. |
| Gelatine 0.75% solution: Gelatine | Sigma-Aldrich | G2500 | 3.75 g gelatine in 500 ml RPMI 1640. Heat to 56 °C to dissolve. Filter sterilize when 56 °C. Store at -20 °C in aliquots. |
| Gelatine 0.75% solution: RPMI 1640 | Lonza | BE12-115F | 3.75 g gelatine in 500 ml RPMI 1640. Heat to 56 °C to dissolve. Filter sterilize when 56 °C. Store at -20 °C in aliquots. |
| Glutamine solution: L-glutamin | Sigma-Aldrich | G3126 | 14.6 g L glutamine in 500 ml 0.9 % NaCl. Dissolve, filter sterilize and store at -20 °C in aliquots. |
| Glutamine solution: HCl | Sigma | H1758 | 14.6 g L glutamine in 500 ml 0.9 % NaCl. Dissolve, filter sterilize and store at -20 °C in aliquots. |
| Hybridization solution: Formamide Bio ultra 99% SSC 20x | Fluka/Sigma | 47671-1l-F | Total 20 ml, keep frozen at -20 °C in aliquots 10 ml deionized formamide |
| Hybridization solution: Denhardt’s 50x concentrate | Sigma | D2532 | 5 ml 20xSSC |
| Hybridization solution: Yeast tRNARoche blocking reagent | Sigma | R-6750 | 2 ml 50x Denhardt’s 250 μl 20 mg per ml yeast tRNA |
| Hybridization solution: Salmon sperm DNA | Fluka/Sigma | 31149-106GF | 0.4 g Roche blocking reagent 1 ml of 10 mg per ml salmon sperm DNA (Critical: denature salmon spermDNA at 96 °C for 5 min before adding to the hybridization solution) |
| Hybridizer ThermoStar 100 HC4 | Quantifoil Instruments GmbH | 1004-0011 | Can be replaced by hybridization oven and RNase free hybridization chambers padded with DEPC water. |
| Immersion oil UV transparent fluorescence free | Sigma | 10976-1EA | |
| Immunofluorescence or confocal microscope | Nikon D-Eclipse TE2000C | ||
| Nailpolish | Available in any drugstore | ||
| PBS 20x:NaCl
KCl Na2HPO4 x 2H2O KH2PO4 DEPC deionized H2O |
Ajust pH to 7.4
160 g 4 g 23 g 4 g 1 l |
||
| Paraformaldehyde 4 % | Fluka/chemika | 76240 | 4 g PFA in 80 ml PBS/DEPC. Heat to 65 °C until the PFA dissolves. Add 20 ml PBS, allow the solution to cool. Adjust the pH to 7.4. Filter. Store in aliquots at -20 °C. |
| Paraformaldehyde 4 %/ Acid acetic 5 % | 950 μl paraformaldhyde + 50 μl Acetic acid | ||
| Pepsin | Sigma/Aldrich | P7000 | |
| Peroxidase-conjugated anti-biotin | Calbiochem | 203206 | |
| RBC-wash media: RPMI 1640 Glutamine solution | Lonza | BE12-115F | 500 ml RPMI 1640 5 ml glutamine solution |
| RBC-wash media: Gentamycin sulfate | Lonza | BE02-012E | 2.5 ml gentamycin sulphate |
| RNase | Sigma/Aldrich | Make a 10 mg/ml stock solution. | |
| RNase free 1.5 ml tube | Ambion | AM12450 | |
| RNase Zap | Ambion | AM9780 | |
| Slides 4 wells 11 mm | Thermo Scientific | MENZXER306W | |
| SSC 20x: NaCl | Sigma/Aldrich | S9625 | 3 M NaCl (175 g/l) 0.3M Na3 citrate x H2O (88 g/l) Adjust to pH 7.0 with 1M HCl |
| SSC 20x: Sodium citrate dehydrate | Sigma/aldrich | W302600 | 3 M NaCl (175 g/l) 0.3M Na3 citrate x H2O (88 g/l) Adjust to pH 7.0 with 1M HCl |
| SSPE 20x: NaCl | Sigma/Aldrich | S9625 | 175.3 g NaCl |
| SSPE 20x: NaH2PO4 | Sigma/Aldrich | S0751 | 27.6 g NaH2PO4. |
| SSPE 20x:4 EDTA powder | 9.4 g EDTA powder Add DEPC water, adjust pH 7.4. Autoclave for 20 min |
||
| TNB buffer: TNT buffer | 10 ml TNT buffer | ||
| TNB buffer: Blocking reagent | 0.05 g Blocking reagent To dissolve the blocking reagent, heat the solution to 60 °C for one hour with stirring. Store at -20 °C. (Derived from the Perkin Elmer TSA-protocol.) |
||
| TNT buffer: Tris/HCl | Sigma | T1503 | 1M Tris/HCl, pH 8.0 |
| TNT buffer: NaCl | Sigma Aldrich | S9625 | 100 ml |
| TNT buffer: Tween20 | Sigma | 93773 | 5 M NaCl 30 ml 1 ml DEPC dH2O 869 Ml Adjust pH to 7.5 at room temperature. (Derived from the Perkin Elmer TSA-protocol.) |
| TSA plus Cyanine3/ Fluorescein system | Perkin Elmer | NEL753000IKT | Read the protocol from the TSA Plus Fluorescence Palette System carefully before starting the experiment. |
| Tubes 14 ml sterile | Almeco – CM LAB Aps | 91016 |
References
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