RNAの蛍光による単一細胞遺伝子転写の解析<em> in situで</em>ハイブリダイゼーション（FISH）
1Centre for Medical Parasitology, Department of International Health, Immunology & Microbiology, Faculty of Health Sciences,University of Copenhagen, 2Department of Infectious Diseases,Copenhagen University Hospital (Rigshospitalet), 3Institute of Infection and Immunology Research, School of Biology,University of Edinburgh
Summary
蛍光灯<em>その場で</em個々の細胞におけるmRNA転写産物を同定する>ハイブリダイゼーション（FISH）は、複数のメンバーを同時に転写などの多遺伝子活性の分析を可能に<em> VAR</em>多重遺伝子ファミリーで<em>熱帯熱マラリア原虫（Plasmodium falciparum）</em>感染した赤血球<sup> 1</sup>。技術が適応さや遺伝子、細胞及び生物のさまざまな種類で使用することができます。
Abstract
マラリア感染時のヒト内皮受容体に熱帯熱マラリア原虫感染赤血球（IE）の接着は 、var遺伝子によってコードされたPfEMP1タンパク質変異体の発現によって媒介される。
ハプロイドP.熱帯熱マラリア原虫のゲノムは1つだけですが、感染症の血液の段階で一度にセルごとに転写されると考えられていたそのうちの約60種類のvarの遺伝子を抱いている。 varの遺伝子転写のような相互に排他的な規制がどのように実現されるか、個々の遺伝子やvarの異なる受容体とPの臨床転帰の差動結合の結果に関連付けられているvarの遺伝子のサブグループの識別があるので、不明である熱帯熱マラリア原虫感染症。最近では、相互に排他的な転写のパラダイムは、個々のPに基づいて転写アッセイによって疑問に呼ばれてきたシングルinfに熱帯熱マラリア原虫の転写産物の同定Pの個々の核内寄生虫によるvarの遺伝子転写のin situハイブリダイゼーション（FISH）分析に蛍光RNAを用いてected赤血球細胞熱帯熱マラリア原虫 、IE 1。
ここでは、Pの単核の var遺伝子転写の解析のためのRNA-FISH法を実施するための詳細なプロトコルを提示熱帯熱マラリア原虫は、ヒト赤血球に感染した。方法はジゴキシゲニンとTSA Plusの蛍光パレットシステム2（パーキンエルマー）、顕微鏡分析と新たに選択されたPを使用してビオチン標識アンチセンスRNAプローブの使用に基づいています熱帯熱マラリア原虫のIE。 in situハイブリダイゼーション法Pのさまざまな段階で発現している遺伝子の多様性の転写および規制を監視するために使用することができます熱帯熱マラリア原虫のライフサイクルとは、他のマラリア原虫種と他の生物や細胞のタイプに適応可能です。
Protocol
1。たての選択感染赤血球の生成 PfEMP1タンパク質の表面発現のために新たに選択したカルチャを使用しているときは、このアッセイのために、最良の結果が得られる。この特定の実験3D7 Pにおける熱帯熱マラリア原虫の系統は、前述の1と特異的な抗体を用いて選択した。 1日目 Pから満員の血液細胞の収穫を200μl ?…
Representative Results
図1に、主な手順やRNA FISH法の持続時間を示すフローチャートである。 シングルPを使用してよく、不十分保存ステンドmRNAのFISH実験の代表的な一連の画像熱帯熱マラリア原虫のIEを図2に示します。この細胞内原虫はDAPIで青色に染色されている小さな（1〜1.5μmの直径）は核を持っています。二十四時間Pの赤血球侵入後<em…
Discussion
のRNA FISH分析は、例えば、ノーザンブロットおよびRT-PCRなどの方法とは対照的に、単一細胞レベルで特定のmRNA転写物の識別を可能にします。これにより、P.、この例では、転写活性および不活性細胞を区別することができ寄生原虫は、ヒト赤血球内原虫。このような全細胞の観察はしばしば必要であり、重要かつ新規な転写パターン1を解明することがあります。
<p cla…Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
著者らは、優れた技術支援のために寄生虫やクリスティーナ·ホルムの遺伝子型のマイケルAlifrangisとウラAbildtrupに感謝したいと思います。この作品はハワードヒューズ医学研究所（助成55005511）、ルンドベック財団（助成R9-A840）およびニールス·ボーア財団によって資金を供給された。
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
| Acetic Acid | Sigma/Aldrich | 338826-100ml | |
| Albumax media: RPMI 1640 Glutamine solution | Lonza | BE12-115F | 500 ml RPMI 1640
5 ml glutamine solution |
| Albumax media: Gentamycin sulphate Albumax-solution | Lonza | BE02-012E | 2.5 ml gentamycin sulphate
50 ml Albumax-solution |
| Albumax-solution: Hypoxanthine | Sigma-Aldrich | H9377 | 0.8 g Hypoxanthine |
| Albumax-solution: AlbuMAX II | Invitrogen | 11021-037 | 200 g Albumax |
| Albumax-solution: RPMI 1640 | Lonza | BE12-115F | 4 liter RPMI 1640
Dissolve with magnet at max. 50 °C. Filter sterilize and store at -20 °C in aliquots. |
| Amberlite | Sigma | A5710-110G | Resin to deionize formamide. |
| Anti-biotin goat pAb Peroxidase Conjugate | Calbiochem | 203206 | |
| Anti-Dig antibody | Novus biologicals | NB100-41330 | |
| Anti-fade reagent with DAPI | Invitrogen | P36931 | The mounting media has to cure for 24 hr before sealing the slide completely. |
| Biotin RNA Labeling Mix | Roche | 11685597910 | |
| Camera digital | Nikon digital sight DC-F11 | ||
| Coverslips | Menzel-glaser | 631-1570 | |
| culture flask 25 cm2 Nunclon surface | Nunc | 156340 | |
| DEPC | Fluka/Sigma | 32490-100ml | 1 ml DEPC in 1000 ml deinonized water. Add a stir bar and stir for 12 hr. Autoclave for 30 min. |
| Digital camera | Nikon digital sight DC-F11 | ||
| Dynabeads Protein A | Invitrogen | 10002D | |
| DynaMaq-15 Magnet | Invitrogen | 123-01D | |
| Formamide bioultra 99 % | Fluka/Sigma | 47671-1l-F | Deionized formamide: 5 g of ion exchange resin per 100 ml of formamide. Stir 30 min. Filter through Whatman paper. |
| Gelatine 0.75% solution: Gelatine | Sigma-Aldrich | G2500 | 3.75 g gelatine in 500 ml RPMI 1640. Heat to 56 °C to dissolve. Filter sterilize when 56 °C. Store at -20 °C in aliquots. |
| Gelatine 0.75% solution: RPMI 1640 | Lonza | BE12-115F | 3.75 g gelatine in 500 ml RPMI 1640. Heat to 56 °C to dissolve. Filter sterilize when 56 °C. Store at -20 °C in aliquots. |
| Glutamine solution: L-glutamin | Sigma-Aldrich | G3126 | 14.6 g L glutamine in 500 ml 0.9 % NaCl. Dissolve, filter sterilize and store at -20 °C in aliquots. |
| Glutamine solution: HCl | Sigma | H1758 | 14.6 g L glutamine in 500 ml 0.9 % NaCl. Dissolve, filter sterilize and store at -20 °C in aliquots. |
| Hybridization solution: Formamide Bio ultra 99% SSC 20x | Fluka/Sigma | 47671-1l-F | Total 20 ml, keep frozen at -20 °C in aliquots 10 ml deionized formamide |
| Hybridization solution: Denhardt’s 50x concentrate | Sigma | D2532 | 5 ml 20xSSC |
| Hybridization solution: Yeast tRNARoche blocking reagent | Sigma | R-6750 | 2 ml 50x Denhardt’s 250 μl 20 mg per ml yeast tRNA |
| Hybridization solution: Salmon sperm DNA | Fluka/Sigma | 31149-106GF | 0.4 g Roche blocking reagent 1 ml of 10 mg per ml salmon sperm DNA (Critical: denature salmon spermDNA at 96 °C for 5 min before adding to the hybridization solution) |
| Hybridizer ThermoStar 100 HC4 | Quantifoil Instruments GmbH | 1004-0011 | Can be replaced by hybridization oven and RNase free hybridization chambers padded with DEPC water. |
| Immersion oil UV transparent fluorescence free | Sigma | 10976-1EA | |
| Immunofluorescence or confocal microscope | Nikon D-Eclipse TE2000C | ||
| Nailpolish | Available in any drugstore | ||
| PBS 20x:NaCl
KCl Na2HPO4 x 2H2O KH2PO4 DEPC deionized H2O |
Ajust pH to 7.4
160 g 4 g 23 g 4 g 1 l |
||
| Paraformaldehyde 4 % | Fluka/chemika | 76240 | 4 g PFA in 80 ml PBS/DEPC. Heat to 65 °C until the PFA dissolves. Add 20 ml PBS, allow the solution to cool. Adjust the pH to 7.4. Filter. Store in aliquots at -20 °C. |
| Paraformaldehyde 4 %/ Acid acetic 5 % | 950 μl paraformaldhyde + 50 μl Acetic acid | ||
| Pepsin | Sigma/Aldrich | P7000 | |
| Peroxidase-conjugated anti-biotin | Calbiochem | 203206 | |
| RBC-wash media: RPMI 1640 Glutamine solution | Lonza | BE12-115F | 500 ml RPMI 1640 5 ml glutamine solution |
| RBC-wash media: Gentamycin sulfate | Lonza | BE02-012E | 2.5 ml gentamycin sulphate |
| RNase | Sigma/Aldrich | Make a 10 mg/ml stock solution. | |
| RNase free 1.5 ml tube | Ambion | AM12450 | |
| RNase Zap | Ambion | AM9780 | |
| Slides 4 wells 11 mm | Thermo Scientific | MENZXER306W | |
| SSC 20x: NaCl | Sigma/Aldrich | S9625 | 3 M NaCl (175 g/l) 0.3M Na3 citrate x H2O (88 g/l) Adjust to pH 7.0 with 1M HCl |
| SSC 20x: Sodium citrate dehydrate | Sigma/aldrich | W302600 | 3 M NaCl (175 g/l) 0.3M Na3 citrate x H2O (88 g/l) Adjust to pH 7.0 with 1M HCl |
| SSPE 20x: NaCl | Sigma/Aldrich | S9625 | 175.3 g NaCl |
| SSPE 20x: NaH2PO4 | Sigma/Aldrich | S0751 | 27.6 g NaH2PO4. |
| SSPE 20x:4 EDTA powder | 9.4 g EDTA powder Add DEPC water, adjust pH 7.4. Autoclave for 20 min |
||
| TNB buffer: TNT buffer | 10 ml TNT buffer | ||
| TNB buffer: Blocking reagent | 0.05 g Blocking reagent To dissolve the blocking reagent, heat the solution to 60 °C for one hour with stirring. Store at -20 °C. (Derived from the Perkin Elmer TSA-protocol.) |
||
| TNT buffer: Tris/HCl | Sigma | T1503 | 1M Tris/HCl, pH 8.0 |
| TNT buffer: NaCl | Sigma Aldrich | S9625 | 100 ml |
| TNT buffer: Tween20 | Sigma | 93773 | 5 M NaCl 30 ml 1 ml DEPC dH2O 869 Ml Adjust pH to 7.5 at room temperature. (Derived from the Perkin Elmer TSA-protocol.) |
| TSA plus Cyanine3/ Fluorescein system | Perkin Elmer | NEL753000IKT | Read the protocol from the TSA Plus Fluorescence Palette System carefully before starting the experiment. |
| Tubes 14 ml sterile | Almeco – CM LAB Aps | 91016 |
References
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Tags
Single-cell Gene TranscriptionRNA Fluorescent In Situ Hybridization (FISH)Plasmodium Falciparum Infected ErythrocytesPfEMP1 Protein VariantsVar GenesMutually Exclusive RegulationTranscription AssaysRNA-FISH MethodologyDigoxigenin-labeled Antisense RNA ProbesBiotin-labeled Antisense RNA ProbesTSA Plus Fluorescence Palette System
Cite This Article
Ronander, E., Bengtsson, D. C., Joergensen, L., Jensen, A. T. R., Arnot, D. E. Analysis of Single-cell Gene Transcription by RNA Fluorescent In Situ Hybridization (FISH). J. Vis. Exp. (68), e4073, doi:10.3791/4073 (2012).