Genöverföring till äldre kycklingembryon med<em> Ex ovo</em> Elektroporering
Summary
En metod för genöverföring in i kycklingembryon vid senare stadier inkubation (äldre än Hamburger och Hamilton steg (HH) 22) beskrivs. Denna metod övervinner nackdelarna hos<em> I ovo</em> Elektroporering tillämpas på äldre kycklingembryon och är en användbar teknik för att studera geners funktion och reglering på äldre utvecklingsstadier.
Abstract
Den kycklingembryo tillhandahåller en utmärkt modellsystem för att studera genfunktion och reglering under embryonal utveckling. In ovo elektroporering är en kraftfull metod för att över-uttrycka exogena gener eller nedreglera endogena gener in vivo i kycklingembryon 1. Olika strukturer, såsom DNA-plasmider gener som kodar 2-4, små störande RNA (siRNA) plasmider 5, liten syntetiskt RNA oligos 6 och morfolino antisensoligonukleotider 7 kan enkelt transfekteras in kycklingembryon genom elektroporation. Dock tillämpningen av i ovo elektroporering begränsas till embryon i tidiga inkubationsbetingelser stadier (yngre än skede HH20 – enligt Hamburg och Hamilton) 8 och det finns vissa nackdelar för dess tillämpning i embryon i senare skeden (äldre än skede HH22 – cirka 3,5 dagar utveckling). Till exempel är vitellinmembranet vid senare stadier Usuallierad fastnat De skall membranet och öppna ett fönster i skalet gör bristning av fartyg, vilket resulterar i döden av embryon, äldre embryon omfattas av vitelline och allantois fartyg, där det är svårt att komma åt och manipulera embryon, äldre embryon gå kraftigt och är svår att reglera orienteringen genom en relativt liten fönster i höljet.
I detta protokoll visar vi ett ex ovo elektroporering metod för genöverföring till kycklingembryon i sena stadier (äldre än steg HH22). För ex ovo elektroporering är embryon odlas i petriskålar 9 och vitelline och allantoiska fartyg spridda. Under dessa betingelser är de äldre kycklingembryon lättillgängliga och manipuleras. Därför övervinner denna metod nackdelarna med i ovo elektroporering tillämpas på de äldre kycklingembryon. Med användning av denna metod, kan plasmider lätt transfekteras in i olika delarav de äldre kycklingembryon 10-12.
Protocol
Discussion
Detta protokoll ger en vägledning för genöverföring till äldre kycklingembryon (t.ex. i optiska tektum vid E6) med ex ovo elektroporation. Denna metod sträcker sig användning av elektroporering för att äldre kycklingembryon och kan lätt tillämpas på många laboratorier för att studera genfunktion in vivo i senare skeden. Embryon från E4 till minst E7 kan framgångsrikt elektroporeras med denna metod och de elektroporerade embryona kan överleva fram till E15 11. Förutom hjärn…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta arbete stöddes av ett bidrag från den tyska Research Foundation (DFG, LU1455/1-1).
Materials
| Name | Company | Catalog Number |
| Electroporator | Nepa Gene, Japan | CUY21-Edit |
| Electrodes | Nepa Gene, Japan | CUY661-3×7 |
| Egg incubator | Ehret, Germany | BSS160 |
| Embryo incubator | BINDER GmbH, Germany | |
| Fluorescent microscope | Keyence, Deutschland GmbH | BZ-8000 |
| Petri dish | Greiner Bio-One GmbH, Germany | |
| Microelectrode puller | World Precision Instruments, Germany | PUL-100 |
References
- Momose, T., Tonegawa, A., Takeuchi, J., Ogawa, H., Umesono, K., Yasuda, K. Efficient targeting of gene expression in chick embryos by microelectroporation. Dev. Growth Differ. 41, 335-344 (1999).
- Luo, J., Ju, M. J., Lin, J., Yan, X., Markus, A., Mix, E., Rolfs, A., Redies, C. Cadherin-20 expression by motor neurons is regulated by Sonic hedgehog during spinal cord development. NeuroReport. 20, 365-370 (2009).
- Luo, J., Ju, M. J., Redies, C. Regionalized cadherin-7 expression by radial glia is regulated by Shh and Pax7 during chicken spinal cord development. Neuroscience. 142, 1133-1143 (2006).
- Nakamura, H., Katahira, T., Sato, T., Watanabe, Y., Funahashi, J. Gain- and loss-of-function in chick embryos by electroporation. Mech. Dev. 121, 1137-1143 (2004).
- Dai, F., Yusuf, F., Farjah, G. H., Brand-Saberi, B. RNAi-induced targeted silencing of developmental control genes during chicken embryogenesis. Dev. Biol. 258, 80-90 (2005).
- Rao, M., Baraban, J. H., Rajaii, F., Sockanathan, S. In vivo comparative study of RNAi methodologies by in ovo electroporation in the chick embryo. Dev. Dyn. 231, 592-600 (2004).
- Kos, R., Tucker, R. P., Hall, R., Duong, T. D., Erickson, C. A. Methods for introducing morpholinos into the chicken embryo. Dev. Dyn. 226, 470-477 (2003).
- Hamburger, V., Hamilton, H. L. A series of normal stages in the development of the chick embryo. J. Morphol. 88, 49-92 (1951).
- Auerbach, R., Kubai, L., Knighton, D., Folkman, J. A simple procedure for the long-term cultivation of chicken embryos. Dev. Biol. 10, 391-394 (1974).
- Luo, J., Treubert-Zimmermann, U., Redies, C. Cadherins guide migrating Purkinje cells to specific parasagittal domains during cerebellar development. Mol. Cell. Neurosci. 25, 138-152 (2004).
- Luo, J., Redies, C. Ex ovo electroporation for gene transfer into older chicken embryos. Dev. Dyn. 233, 1470-1477 (2005).
- Treubert-Zimmermann, U., Heyers, D., Redies, C. Targeting axons to specific fiber tracts in vivo by altering cadherin expression. J. Neurosci. 22, 7617-7626 (2002).
