En metod för genöverföring in i kycklingembryon vid senare stadier inkubation (äldre än Hamburger och Hamilton steg (HH) 22) beskrivs. Denna metod övervinner nackdelarna hos<em> I ovo</em> Elektroporering tillämpas på äldre kycklingembryon och är en användbar teknik för att studera geners funktion och reglering på äldre utvecklingsstadier.
Den kycklingembryo tillhandahåller en utmärkt modellsystem för att studera genfunktion och reglering under embryonal utveckling. In ovo elektroporering är en kraftfull metod för att över-uttrycka exogena gener eller nedreglera endogena gener in vivo i kycklingembryon 1. Olika strukturer, såsom DNA-plasmider gener som kodar 2-4, små störande RNA (siRNA) plasmider 5, liten syntetiskt RNA oligos 6 och morfolino antisensoligonukleotider 7 kan enkelt transfekteras in kycklingembryon genom elektroporation. Dock tillämpningen av i ovo elektroporering begränsas till embryon i tidiga inkubationsbetingelser stadier (yngre än skede HH20 – enligt Hamburg och Hamilton) 8 och det finns vissa nackdelar för dess tillämpning i embryon i senare skeden (äldre än skede HH22 – cirka 3,5 dagar utveckling). Till exempel är vitellinmembranet vid senare stadier Usuallierad fastnat De skall membranet och öppna ett fönster i skalet gör bristning av fartyg, vilket resulterar i döden av embryon, äldre embryon omfattas av vitelline och allantois fartyg, där det är svårt att komma åt och manipulera embryon, äldre embryon gå kraftigt och är svår att reglera orienteringen genom en relativt liten fönster i höljet.
I detta protokoll visar vi ett ex ovo elektroporering metod för genöverföring till kycklingembryon i sena stadier (äldre än steg HH22). För ex ovo elektroporering är embryon odlas i petriskålar 9 och vitelline och allantoiska fartyg spridda. Under dessa betingelser är de äldre kycklingembryon lättillgängliga och manipuleras. Därför övervinner denna metod nackdelarna med i ovo elektroporering tillämpas på de äldre kycklingembryon. Med användning av denna metod, kan plasmider lätt transfekteras in i olika delarav de äldre kycklingembryon 10-12.
Detta protokoll ger en vägledning för genöverföring till äldre kycklingembryon (t.ex. i optiska tektum vid E6) med ex ovo elektroporation. Denna metod sträcker sig användning av elektroporering för att äldre kycklingembryon och kan lätt tillämpas på många laboratorier för att studera genfunktion in vivo i senare skeden. Embryon från E4 till minst E7 kan framgångsrikt elektroporeras med denna metod och de elektroporerade embryona kan överleva fram till E15 11. Förutom hjärn…
The authors have nothing to disclose.
Detta arbete stöddes av ett bidrag från den tyska Research Foundation (DFG, LU1455/1-1).
Name | Company | Catalog Number |
Electroporator | Nepa Gene, Japan | CUY21-Edit |
Electrodes | Nepa Gene, Japan | CUY661-3×7 |
Egg incubator | Ehret, Germany | BSS160 |
Embryo incubator | BINDER GmbH, Germany | |
Fluorescent microscope | Keyence, Deutschland GmbH | BZ-8000 |
Petri dish | Greiner Bio-One GmbH, Germany | |
Microelectrode puller | World Precision Instruments, Germany | PUL-100 |