Il trasferimento genico in embrioni di pollo da anziani<em> Ex ovo</em> Elettroporazione
Summary
Un metodo di trasferimento genico in embrioni di pollo in fasi successive di incubazione (più di Hamburger e Hamilton stadio (HH) 22) è descritto. Questo metodo supera inconvenienti<em> In ovo</emElettroporazione> applicata a embrioni di pollo anziani ed è una tecnica utile per studiare la funzione regolazione dei geni e alle vecchie stadi di sviluppo.
Abstract
L'embrione di pollo fornisce un ottimo sistema modello per studiare la funzione del gene e la regolazione durante lo sviluppo embrionale. In elettroporazione ovo è un metodo efficace per geni esogeni over-espressa o down-regolare i geni endogeni in vivo in embrioni di pollo 1. Di strutture diverse come i geni codificanti del DNA plasmidi 2-4, piccoli RNA interferenti (siRNA) 5 plasmidi, piccoli RNA sintetico oligos 6 e 7 morpholino oligonucleotidi antisenso può essere facilmente trasfettati in embrioni di pollo mediante elettroporazione. Tuttavia, l'applicazione di elettroporazione in ovo è limitata a embrioni nelle fasi iniziali di incubazione (meno di stage HH20 – in base ad Amburgo e Hamilton) 8 e ci sono alcuni svantaggi per la sua applicazione in embrioni in fasi successive (più vecchio di stage HH22 – circa 3,5 giorni di sviluppo). Ad esempio, la membrana vitellina in fasi successive è solitamentealleato attaccato alla membrana deve e aprendo una finestra nel guscio provoca la rottura dei vasi, con conseguente morte degli embrioni; vecchi embrioni sono coperti da navi vitellina e allantoico, dove è difficile accedere e manipolare gli embrioni; vecchi embrioni spostare vigorosamente ed è difficile controllare l'orientamento attraverso una finestra relativamente piccola nel guscio.
In questo protocollo si dimostra un metodo di elettroporazione ex ovo per il trasferimento del gene in embrioni di pollo nelle fasi tardive (di età superiore a stage HH22). Per elettroporazione ex ovo, gli embrioni vengono coltivati in piastre di Petri 9 e il vitellino e vasi allantoide sono ampiamente diffuse. In queste condizioni, gli embrioni di pollo anziani sono facilmente accessibili e manipolati. Pertanto, questo metodo supera gli svantaggi della elettroporazione in ovo applicata ai vecchi embrioni di pollo. Utilizzando questo metodo, plasmidi possono essere facilmente trasfettato in parti differentidegli embrioni di pollo anziani 10-12.
Protocol
Discussion
Questo protocollo fornisce una guida per il trasferimento del gene in embrioni di pollo grandi (ad esempio, nel tetto ottico a E6) di elettroporazione ex ovo. Questo metodo estende l'utilizzo di elettroporazione di embrioni di pollo anziani e può essere facilmente applicato a molti laboratori per lo studio della funzione genica in vivo in fasi successive. Gli embrioni da E4 ad almeno E7 può essere successo elettroporate con questo metodo e gli embrioni possono essere elettroporate sopravvivenza f…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato sostenuto da un finanziamento della Fondazione per la ricerca tedesco (DFG, LU1455/1-1).
Materials
| Name | Company | Catalog Number |
| Electroporator | Nepa Gene, Japan | CUY21-Edit |
| Electrodes | Nepa Gene, Japan | CUY661-3×7 |
| Egg incubator | Ehret, Germany | BSS160 |
| Embryo incubator | BINDER GmbH, Germany | |
| Fluorescent microscope | Keyence, Deutschland GmbH | BZ-8000 |
| Petri dish | Greiner Bio-One GmbH, Germany | |
| Microelectrode puller | World Precision Instruments, Germany | PUL-100 |
References
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