एक कैप्चर एलिसा के Luminex Xmap परख एक मल्टीप्लेक्स एंटीबॉडी स्क्रीनिंग विधि का उपयोग करने के लिए रूपांतरण

Summary

एक एलिसा आसानी से Luminex Xmap परख के करने के लिए परिवर्तित किया जा सकता है और बहुसंकेतन, कई एंटीबॉडी के लाभ के माध्यम से एक साथ जांच की जा सकती है के लिए एक इष्टतम प्रतिरक्षी जोड़ी की पहचान करने के लिए, वृद्धि की संवेदनशीलता और गतिशील रेंज में जिसके परिणामस्वरूप, जबकि लागत को कम करने परख.

Abstract

The enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) has long been the primary tool for detection of analytes of interest in biological samples for both life science research and clinical diagnostics. However, ELISA has limitations. It is typically performed in a 96-well microplate, and the wells are coated with capture antibody, requiring a relatively large amount of sample to capture an antigen of interest . The large surface area of the wells and the hydrophobic binding of capture antibody can also lead to non-specific binding and increased background. Additionally, most ELISAs rely upon enzyme-mediated amplification of signal in order to achieve reasonable sensitivity. Such amplification is not always linear and can thus skew results.

In the past 15 years, a new technology has emerged that offers the benefits of the ELISA, but also enables higher throughput, increased flexibility, reduced sample volume, and lower cost, with a similar workflow ^{1, 2}. Luminex xMAP Technology is a microsphere (bead) array platform enabling both monoplex and multiplex assays that can be applied to both protein and nucleic acid applications ^3-5. The beads have the capture antibody covalently immobilized on a smaller surface area, requiring less capture antibody and smaller sample volumes, compared to ELISA, and non-specific binding is significantly reduced. Smaller sample volumes are important when working with limiting samples such as cerebrospinal fluid, synovial fluid, etc. ⁶. Multiplexing the assay further reduces sample volume requirements, enabling multiple results from a single sample.

Recent improvements by Luminex include: the new MAGPIX system, a smaller, less expensive, easier-to-use analyzer; Low-Concentration Magnetic MagPlex Microspheres which eliminate the need for expensive filter plates and come in a working concentration better suited for assay development and low-throughput applications; and the xMAP Antibody Coupling (AbC) Kit, which includes a protocol, reagents, and consumables necessary for coupling beads to the capture antibody of interest. (See Materials section for a detailed list of kit contents.)

In this experiment, we convert a pre-optimized ELISA assay for TNF-alpha cytokine to the xMAP platform and compare the performance of the two methods ^7-11. TNF-alpha is a biomarker used in the measurement of inflammatory responses in patients with autoimmune disorders.

We begin by coupling four candidate capture antibodies to four different microsphere sets or regions. When mixed together, these four sets allow for the simultaneous testing of all four candidates with four separate detection antibodies to determine the best antibody pair, saving reagents, sample and time. Two xMAP assays are then constructed with the two most optimal antibody pairs and their performance is compared to that of the original ELISA assay in regards to signal strength, dynamic range, and sensitivity.

Protocol

I. अभिकर्मक तैयार एंटीबॉडी चयन और तैयार प्रयोग में इस्तेमाल किया जा एंटीबॉडी को पहचानें. चार पर कब्जा एंटीबॉडी विशिष्ट मानव TNF-अल्फा, या तो मोनोक्लोनल या पॉलीक्लोनल के लिए, सभी एक ही मेजबान प्रजातियों. चार एंटीबॉडी का पता लगाने: मानव TNF-अल्फा, या तो अपरिवर्तित, biotinylated, या पीई संयुग्मित के लिए विशिष्ट. एक पुष्टिकरण प्रतिरक्षी: पीई संयुग्मित और कब्जा एंटीबॉडी के मेजबान प्रजातियों के लिए विशिष्ट है. निर्माता की सिफारिश कर सांद्रता के लिए सभी एंटीबॉडी reconstitute. कम एकाग्रता MagPlex microsphere (मनका) सेट या क्षेत्रों के चार शीशियों का चयन करें, उदाहरण के लिए, Luminex भाग संख्या MC10012 आईडी, MC10013 आईडी, MC10014 आईडी, और MC10015 आईडी. MagPlex microspheres एंटीबॉडी युग्मन, Xmap (एबीसी) एंटीबॉडी युग्मन किट का उपयोग फिर सेपूरा युग्मन प्रक्रिया के लिए एबीसी किट उपयोगकर्ता के मैनुअल (पार्ट 89-00002-00-319) fer. (नोट: सहज microspheres के प्रकाश से रक्षा की जानी चाहिए जब भी संभव है.) कमरे और मनका क्षेत्र युग्मन प्रतिक्रिया के लिए चयनित संख्या के साथ तापमान चार लेबल प्रतिक्रिया ट्यूबों एबीसी किट में अभिकर्मकों लाओ. चार लेबल प्रतिक्रिया ट्यूबों में MagPlex मोतियों की चार शीशियों (1 एमएल प्रत्येक या 2.5 x 10 6 मोती) की सामग्री हस्तांतरण. मनका सेट में से प्रत्येक के दो बार धो के सक्रियकरण बफर के रूप में एबीसी किट पुस्तिका में वर्णित के 500 μL में. प्रत्येक मनका सेट सक्रिय सक्रियकरण बफर, Sulfo एन एच एस के 10 μL, और EDC के अभिकर्मक के 10 μL 480 μL साथ, एबीसी किट पुस्तिका में प्रक्रिया के अनुसार, और 20 मिनट के लिए सेते हैं. (नोट: EDC के अभिकर्मक सक्रियकरण बफर की 250 μL तुरंत इस कदम के लिए पूर्व में पुनर्गठन किया जाना चाहिए.) अब "सक्रिय" microspheres के साथ पिछले धोने thr की कुल कदम दोहराएँ500 सक्रियकरण बफर की μL के साथ ई बार, के रूप में एबीसी किट के मैनुअल में वर्णित है. चार अलग समाधान, सक्रियकरण बफर में कब्जा एंटीबॉडी के प्रत्येक युक्त 7.5 μg (यानी, 3 μg / मिलियन microspheres) तैयार करें. इन चार कब्जा एंटीबॉडी समाधान उनके संबंधित प्रतिक्रिया ट्यूबों के लिए जोड़ें, भंवर प्रत्येक ट्यूब तुरंत, और अंग को घुमानेवाली पेशी पर दो घंटे के लिए सेते हैं. अब "मिलकर microspheres धो बफर एबीसी किट के साथ शामिल की 500 μL के साथ तीन बार की कुल के साथ पिछले धोने कदम दोहराएँ. अंतिम धोने कदम के बाद, प्रत्येक प्रतिक्रिया ट्यूब के लिए 500 μL धो बफर जोड़ने के लिए पचास लाख प्रति मिली लीटर प्रतिरक्षी मिलकर मोती की एक अंतिम स्टॉक एकाग्रता प्रदान. भंवर और प्रतिक्रिया ट्यूबों sonicate microspheres फैलाने. नोट: आंशिक रूप से बंद microsphere शीशी डि पानी से भरा एक अल्ट्रासोनिक क्लीनर में submerging सभी धोने चरणों के लिए प्रभावी sonication प्रदान करता है. (ई के लिए सामग्री तालिका देखेंquipment विवरण.) 2-8 पर स्टोर मिलकर मोती डिग्री सेल्सियस और प्रकाश से संरक्षित जब तक की जरूरत है. युग्मित microspheres की गणन युग्मन एक सेल काउंटर या hemacytometer के के का उपयोग कर प्रतिक्रिया के बाद बरामद microspheres की संख्या गिनें. ऐसा करने के लिए उचित निर्देश लिए गिनती साधन उपयोगकर्ता पुस्तिका का संदर्भ लें. युग्मन प्रतिक्रिया से वसूली आमतौर पर 90% से अधिक है. युग्मन पुष्टि युग्मन प्रतिक्रिया की पुष्टि परख बफर में 100 मोती / μL के अंतिम एकाग्रता (1% BSA साथ पीबीएस) के साथ मिलकर मनका शेयरों के प्रत्येक सेट के लिए परीक्षण समाधान की तैयारी द्वारा सफल था. 4 / परख बफर में μg एमएल phycoerythrin (पीई) लेबल विरोधी प्रजातियों आईजीजी पुष्टि एंटीबॉडी की dilutions के तैयार हो जाओ. अशेष भाजक एक गोल नीचे, 96 अच्छी तरह से थाली के चार कुओं में 16 कुओं की कुल के लिए, प्रत्येक परीक्षण समाधान का 50 μL. फिर 50 μ जोड़नेपरख बफर के कुओं की आठ में एल, पृष्ठभूमि, और आठ शेष कुओं में 50 μL पतला पुष्टि एंटीबॉडी के उपाय. Pipetting और नीचे एक pipettor मल्टी चैनल के साथ कई बार प्रतिक्रियाओं धीरे मिश्रण. प्लेट कवर, और एक थाली प्रकार के बरतन पर कमरे के तापमान पर 30 मिनट के लिए सेते हैं. एक चुंबकीय थाली विभाजक पर 1-2 मिनट के लिए समाधान से बाहर मोती आकर्षित प्लेट रखें. तो, जबरदस्ती inverting के थाली से तरल निकालने के लिए, जबकि विभाजक पर बर्बादी गोदाम पर. प्रत्येक अच्छी तरह से धो दो बार परख बफर के 100 μL जोड़ने और एक समान चुंबकीय थाली विभाजक का उपयोग फैशन में थाली से सतह पर तैरनेवाला को हटाने के द्वारा. धीरे से ऊपर pipetting और नीचे एक pipettor मल्टी चैनल के साथ पांच बार के से परख बफर 100 μL में मोती Resuspend. MAGPIX साधन के रूप में एक Luminex Xmap साधन, पर विश्लेषण. इस प्रतिक्रिया के फ्लोरोसेंट संकेत की तीव्रता directl हैवाई मोतियों की सतह पर प्रोटीन की मात्रा के समानुपाती, प्रोटीन के रिश्तेदार राशि मोतियों के लिए युग्मित की एक तेजी से मूल्यांकन प्रदान. असंशोधित एंटीबॉडी का पता लगाने के लिए बायोटिन युग्मन असंशोधित पता लगाने के एंटीबॉडी का उपयोग अगर, थर्मो फिशर ईज़ी लिंक Sulfo – एन एच एस-LC – बायोटिन (Cat. नहीं PI – 21,335) अभिकर्मक और पैकेज डालने में वर्णित प्रक्रिया के साथ इन एंटीबॉडी biotinylate के. एक बार biotinylated, बाद में पता लगाने के एंटीबॉडी streptavidin परख में (SA पीई) phycoerythrin (III.6 चरण) के साथ लेबल किया जा सकता है इतना है कि वे को Xmap विश्लेषक के साथ पता लगाया जा सकता है. द्वितीय. परख सेटअप पीबीएस के 0.96 एमएल 1% (परख बफर सामग्री तालिका देखें.) बीएसए के लिए निर्धारित है जो Xmap परख के साथ सबसे प्रभावी है के साथ प्रत्येक के 10 μL जोड़कर सभी चार मनका सेट के एक प्रारंभिक मिश्रण तैयार करें. दिल से पता लगाने के एंटीबॉडी समाधान तैयार1 μg / परख बफर में एमएल प्रत्येक uting. 2000 में स्नातकोत्तर एमएल / परख बफर में अनुसंधान एवं विकास सिस्टम प्रोटीन TNF-α मानक तैयार करें. 8 परख बफर में μg / एमएल streptavidin-rPhycoerythrin के (SA पीई) (@ 1 मिलीग्राम / एमएल) प्रदान पतला. III. एंटीबॉडी स्क्रीनिंग Costar दौर जांच परख के लिए नीचे 96 अच्छी तरह से थाली के 16 कुओं में से प्रत्येक के लिए प्रतिरक्षी युग्मित microsphere मिश्रण 50 μL जोड़ें. 8 16 कुओं की परख बफर के 50 μL जोड़ें, पृष्ठभूमि को मापने. अन्य 8 कुओं अनुसंधान एवं विकास सिस्टम TNF-α मानक (2,000 स्नातकोत्तर / एमएल) की 50 μL जोड़ें, के जवाब उपाय. कमरे के तापमान, प्रकाश से संरक्षित में एक घंटे के लिए सेते हैं, जबकि एक परख थाली प्रकार के बरतन को मिलाते हुए. चार का पता लगाने के एंटीबॉडी के प्रत्येक के चार कुओं (दो पृष्ठभूमि और दो प्रतिक्रिया) के लिए 50 μL जोड़ें और कमरे के तापमान पर 30 मिनट, प्रकाश से रक्षा के लिए सेते हैं, जबकि एक परख थाली शा पर मिलाते हुएKER. सभी कुओं के अभिकर्मक SA पीई 50 μL जोड़ें और कमरे के तापमान पर 15 मिनट सेते हैं, प्रकाश से सुरक्षित है, जबकि एक परख थाली प्रकार के बरतन पर मिलाते हुए. एक मिनट के लिए एक चुंबकीय थाली विभाजक पर थाली प्लेस और फिर जबरदस्ती inverting के थाली से तरल को हटाने. 16 कुओं के प्रत्येक के लिए 100 μL परख बफर जोड़ने के लिए, एक मिनट के लिए चुंबकीय थाली विभाजक पर थाली और जगह तो जबरदस्ती inverting के थाली से जबकि विभाजक पर तरल निकालने. 16 कुओं के प्रत्येक के लिए 100 परख बफर की μL जोड़ें और Luminex MAGPIX साधन के साथ थाली पढ़ा, उचित ऑपरेशन के लिए उपयोगकर्ता पुस्तिका जिक्र है. एक एंटीबॉडी जोड़ी है कि अपने वांछित सिग्नल की शक्ति मिलती है. चतुर्थ. Xmap कार्यात्मक परख सबसे अच्छा पर कब्जा एंटीबॉडी का चयन करने के बाद, 10 परख बफर के साथ एमएल कि एंटीबॉडी युग्मित मनका स्टॉक के 100 μL (IB8 कदम से) पतला. 50 की μL जोड़ेंमोती दो costar दौर-96 अच्छी तरह से नीचे प्लेटों के 78 कुओं पतला. (78 कुओं एक्स 2 प्लेटें = 156 कुओं) प्रत्येक थाली करने के लिए एक अलग पहचान एंटीबॉडी के प्रदर्शन का आकलन किया जाएगा. एक 12 सूत्री मानक वक्र की तैयारी, 8000 में शुरू स्नातकोत्तर / एमएल और 4 बजे समाप्त अनुसंधान एवं विकास सिस्टम TNF-α मानक के साथ स्नातकोत्तर / एमएल. परख बफर प्रत्येक के 50 μL साथ में छह 50 μL प्लेटों के प्रत्येक के लिए प्रत्येक कमजोर पड़ने की प्रतिकृति है, प्लस छह कुओं को जोड़ने के लिए, एक पृष्ठभूमि के रूप में 78 कुओं / प्लेट की कुल के लिए. एक घंटे के लिए कमरे के तापमान, प्रकाश से सुरक्षित प्लेटें, सेते हैं, जबकि एक परख थाली प्रकार के बरतन पर मिलाते हुए. पहले थाली के सभी 78 कुओं पहले पता लगाने के एंटीबॉडी के 50 μL जोड़ें. दूसरी प्लेट पर दूसरे का पता लगाने के एंटीबॉडी के लिए दोहराएँ. 30 मिनट के लिए प्लेटें कमरे के तापमान, प्रकाश से रक्षा जब परख थाली प्रकार के बरतन पर मिलाते हुए, सेते हैं. प्रत्येक प्लेट के सभी कुओं के अभिकर्मक SA पीई 50 μL जोड़ें. सेना15 मिनट के लिए दो प्लेटें, कमरे के तापमान पर, प्रकाश से संरक्षित जबकि एक परख थाली प्रकार के बरतन को मिलाते हुए. एक मिनट के लिए चुंबकीय थाली विभाजक पर प्लेटें प्लेस, तो जबरदस्ती inverting थाली से विभाजक पर, जबकि तरल निकालने. प्लेटों पर 78 कुओं में से प्रत्येक के लिए 100 परख बफर की μL जोड़ें, एक मिनट के लिए चुंबकीय थाली विभाजक पर प्लेटें जगह तो जबरदस्ती inverting के थाली से तरल को हटा दें. प्लेटों पर 78 कुओं में से प्रत्येक के लिए 100 परख बफर की μL जोड़ें और विश्लेषण MAGPIX साधन पर, उचित ऑपरेशन के लिए उपयोगकर्ता पुस्तिका का जिक्र है. वी. एलिसा परख सिस्टम अनुसंधान एवं विकास मानव TNF-α/TNFSF1A DuoSet एलिसा किट (आर एंड डी भाग DY210 #) के साथ शामिल निर्देशों का पालन, अनुसंधान एवं विकास किट के साथ प्रदान की मानक द्वारा उत्पन्न की प्रतिक्रिया को मापने. एलिसा परख तीन बार दोहराएँ, आर एंड डी सिस्टम पर कब्जा और चींटी का पता लगाने के प्रतिस्थापनअन्य विक्रेताओं के एंटीबॉडी के साथ ibodies. सादगी, जोड़ी विक्रेता द्वारा एंटीबॉडी (जैसे, Millipore कब्जा एंटीबॉडी Millipore का पता लगाने के एंटीबॉडी के साथ, Abcam Abcam पता लगाने के एंटीबॉडी के साथ कब्जा एंटीबॉडी, आदि) के लिए. प्रत्येक जोड़ी के स्वतंत्र रूप से मूल्यांकन, के रूप में एलिसा प्रारूप में आवश्यक प्रत्येक तीन TNF-α प्रोटीन मानकों के साथ,. छठी. प्रतिनिधि परिणाम इस प्रोटोकॉल को दर्शाता है कैसे एक ठेठ एलिसा को Xmap मंच करने के लिए परिवर्तित किया जा सकता है, जबकि प्रौद्योगिकी की मल्टीप्लेक्स क्षमता का उपयोग करने के लिए तेजी से परख अनुकूलन. इस उदाहरण में प्रयुक्त एलिसा मानव ट्यूमर परिगलन फैक्टर – अल्फा (TNF-α) आर एंड डी सिस्टम से DuoSet एलिसा किट (आर एंड डी भाग DY210 #) था. प्रतिरक्षी किट में प्रदान की जोड़ी के अलावा तीन विभिन्न स्रोतों (सामग्री तालिका देखें) से अन्य प्रतिरक्षी जोड़े एक साथ मूल्यांकन किया गया Xmap मंच का उपयोग. के लिएएंटीबॉडी के उर कब्जा एंटीबॉडी के रूप में नामित किया गया और MagPlex कम एकाग्रता microspheres मिलकर. अन्य चार एंटीबॉडी का पता लगाने के एंटीबॉडी के रूप में नामित किया गया, जिनमें से तीन बायोटिन के रूप में मिलकर खरीदे गए थे और चौथे के रूप में प्रोटोकॉल में वर्णित biotinylated किया गया था. इस अध्ययन के लिए एंटीबॉडी उपलब्धता और विक्रेता के आधार पर चुने गए हैं. हालांकि, व्यावहारिक सेटिंग में, एंटीबॉडी व्यक्ति उपयोगकर्ता की वरीयता और कि एंटीबॉडी के साथ पिछले प्रदर्शन के अनुभव के आधार पर चुना जाना चाहिए. हालांकि, इस प्रयोग कब्जा एंटीबॉडी बनाम एंटीबॉडी का पता लगाने के रूप में एक एंटीबॉडी की उपयुक्तता का परीक्षण नहीं है, इस प्रोटोकॉल को आसानी से उस उद्देश्य के लिए संशोधित किया जा सकता है. Luminex Xmap assays एक मिश्रण के रूप में सभी चार पर कब्जा एंटीबॉडी का मूल्यांकन मल्टीप्लेक्स के रूप में TNF-α के एंटीबॉडी मिलकर MagPlex microspheres की चार सेट के संयोजन के द्वारा प्रदर्शन किया गया. कब्जा एंटीबॉडी चार में से प्रत्येक के साथ मूल्यांकन किया गयाव्यक्तिगत biotinylated पता लगाने के एंटीबॉडी, जैसे कि चार पर कब्जा एंटीबॉडी के प्रत्येक के साथ एक का पता लगाने के एंटीबॉडी की बातचीत एक साथ निर्धारित किया जा सकता है. चार ऐसे assays के समानांतर में प्रदर्शन, सभी चार पर कब्जा एंटीबॉडी के साथ सभी चार एंटीबॉडी का पता लगाने बातचीत निर्धारित चित्रा 1 इन स्क्रीनिंग assays से तुलनात्मक आंकड़ों से पता चलता है. परिणाम संकेत दिया कि अनुसंधान और विकास सिस्टम DuoSet से एंटीबॉडी जोड़ी 6183 माध्य प्रतिदीप्ति (एमएफआई) तीव्रता इकाइयों में जिसके परिणामस्वरूप प्रतिक्रिया के साथ सबसे अच्छा प्रदर्शन किया. यह भी देखा गया है कि (आर एंड डी एंटीबॉडी जोड़ी प्रतिक्रिया का 86%) Millipore और Abcam के (67%) से पता लगाने के एंटीबॉडी Xmap परख में एक उचित प्रतिक्रिया प्रदान की है, जब आर एंड डी सिस्टम पर कब्जा एंटीबॉडी के साथ संयुक्त. Abcam, Millipore और Novus से कब्जा एंटीबॉडी Xmap परख में कम वांछनीय प्रतिक्रिया का उत्पादन किया. यह नोट करना महत्वपूर्ण है कि purइस अध्ययन का ढोंग जरूरी विशेष एंटीबॉडी या विक्रेताओं के बीच मतभेदों को वर्णन करने के लिए, लेकिन केवल कि उनके प्रदर्शन में नमूदार मतभेद जब इसी तरह की शर्तों के तहत इस्तेमाल किया जाता है, और Xmap मंच इन मतभेदों का आकलन करने का एक कारगर साधन की पेशकश कर सकते हैं कि नहीं पर प्रकाश डाला है. अनुसंधान एवं विकास सिस्टम DuoSet प्रोटोकॉल एलिसा प्रारूप में चार एंटीबॉडी जोड़े में तुलना करने के लिए इस्तेमाल किया गया था. अनुसंधान एवं विकास सिस्टम प्रोटोकॉल सभी एंटीबॉडी जोड़े के साथ इस्तेमाल किया गया था क्योंकि यह ठेठ एलिसा आज व्यापक रूप से इस्तेमाल किया प्रोटोकॉल के चिंतनशील है और यह Xmap प्रौद्योगिकी के साथ इस्तेमाल किया प्रोटोकॉल के अनुरूप है. एलिसा परीक्षण से पता चला है कि अनुसंधान एवं विकास प्रणाली से एंटीबॉडी जोड़ी फिर सबसे अच्छा परिणाम (चित्रा 2) दिया. Abcam से प्रतिरक्षी जोड़ी और Millipore और Novus उत्पादन मामूली प्रतिक्रियाओं से प्रतिक्रिया एंटीबॉडी जोड़े के उत्पादन. आदेश में मानक साथ प्रतिरक्षी जेट में किसी भी परिवर्तन का आकलन करने के लिए, सभी चार antibody के जोड़े तीन अलग पुनः संयोजक प्रोटीन मानकों TNF-α के साथ परीक्षण किया गया, तीन अलग अलग विक्रेताओं से (सामग्री तालिका देखें). चित्रा 2 शो में डेटा है कि पुनः संयोजक TNF-α तीन विक्रेताओं से प्रोटीन मानकों बराबर परिणाम दे दी है. आर एंड डी सिस्टम से प्रोटीन TNF-α (तालिका 1) एलिसा और Xmap assays के (2 टेबल्स और 3) के साथ मानक घटता उत्पन्न करने के लिए इस्तेमाल किया गया था. जबकि एलिसा परख अनुसंधान एवं विकास प्रणाली एंटीबॉडी जोड़ी के साथ किया गया था, Xmap assays अनुसंधान एवं विकास सिस्टम या Millipore से अनुसंधान और विकास सिस्टम पर कब्जा एंटीबॉडी और या तो पता लगाने के एंटीबॉडी का उपयोग किया. आर एंड डी सिस्टम से प्रोटीन TNF-α 8000 से 4 स्नातकोत्तर / एमएल सांद्रता की एक श्रृंखला का उत्पादन पतला था. केवल अनुसंधान एवं विकास प्रणाली से एंटीबॉडी जोड़ी Xmap परख में अपेक्षित परिणाम का उत्पादन किया, एक प्रतिक्रिया> 20,000 एमएफआई के साथ, के रूप में तालिका 2 में दिखाया औरचित्रा 3. जब Millipore से पता लगाने के एंटीबॉडी अनुसंधान एवं विकास सिस्टम का पता लगाने के एंटीबॉडी की जगह (3 टेबल), प्रतिक्रिया (6,000 एमएफआई) आर एंड डी सिस्टम से पता लगाने के एंटीबॉडी के साथ प्राप्त की प्रतिक्रिया के बारे में 30% थी में Xmap परख के साथ इस्तेमाल किया गया था, के रूप में दिखाया चित्रा 3. तालिका 1 में डेटा एलिसा, जो एक निर्माता की सिफारिश की सीमा 16-1000 स्नातकोत्तर / एमएल TNF-α था के मानक वक्र का प्रतिनिधित्व करता है. इस रेंज बहुत सीमित था, क्योंकि 1000 में आयुध डिपो स्नातकोत्तर / एमएल 2 आयुध डिपो इकाइयों की तुलना में थोड़ा अधिक था और स्पेक्ट्रोफोटोमीटर 3 आयुध डिपो ऊपर उपाय करने में असमर्थ है. स्पेक्ट्रोफोटोमीटर साथ सीमा की वजह से, यह संभव एलिसा परख की सीमा आगे बढ़ाने के लिए नहीं था. इसके अतिरिक्त, तालिका 1 में आंकड़ों से संकेत मिलता है कि अनुसंधान और विकास सिस्टम DuoSet एलिसा TNF-α 16 / स्नातकोत्तर एमएल की तुलना में बहुत कम सांद्रता का पता लगाने में सक्षम नहीं है. दूसरी ओर, Xmap परख measur में सक्षम हैआर एंड डी या तो अनुसंधान एवं विकास सिस्टम या Millipore से पता लगाने के एंटीबॉडी के साथ संयुक्त सिस्टम से कब्जा एंटीबॉडी के साथ 7.8 कम से कम स्नातकोत्तर / एमएल के एक एकाग्रता में आईएनजी TNF-α. गतिशील रेंज और दोनों तरीकों की संवेदनशीलता को बेहतर जब लॉग लॉग पैमाने में प्लॉट किए जाते (चित्रा 4) सचित्र है. एलिसा Xmap assays के से प्रतिक्रियाओं और प्रतिक्रियाओं की ढलान के बीच एक स्पष्ट अंतर देखा जा सकता है कि आगे TNF-α की एलिसा के साथ पता लगाने के लिए एक और अधिक सीमित दोनों उच्च और कम सांद्रता में, क्षमता का संकेत कर सकते हैं. दो कार्यात्मक TNF-α Xmap assays के लिए पहचान (लोद) की सीमा मनाया प्रतिक्रिया स्तर (एमएफआई) पृष्ठभूमि से अधिक से अधिक तीन बार मानक विचलन (एसडी) के साथ सबसे कम एकाग्रता TNF-α की पहचान के द्वारा अनुमानित किया गया. सांख्यिकीय महत्व को प्राप्त करने के लिए, छह प्रतिकृति एसडी Xmap और एलिसा दोनों तरीकों के लिए निर्धारित करने के लिए इस्तेमाल किया गया. Thesलोद की ई अनुमान आशावादी हैं और समझ है कि केवल दो या तीन सामान्य संचालन की शर्तों में उपयोग किया जाएगा प्रतिकृति के साथ एक "सबसे अच्छा मामले परिदृश्य, प्रदान करने का इरादा कर रहे हैं. तालिका 2 में यह देखा जा सकता है कि, जब आर एंड डी सिस्टम जोड़ी, सबसे कम 3.91 पर एकाग्रता TNF-α का उपयोग स्नातकोत्तर / एमएल 66 एमएफआई, जो + पृष्ठभूमि 3SD की प्रतिक्रिया से अधिक है एक प्रतिक्रिया का उत्पादन कर सकते हैं, इस मापदंड को पूरा करने . जब Millipore का पता लगाने के एंटीबॉडी अनुसंधान एवं विकास सिस्टम पर कब्जा एंटीबॉडी (तालिका 3) के साथ इस्तेमाल किया गया था, पता लगाने की सीमा 7.81 कम से स्नातकोत्तर / एमएल था. इस मामले में, 2 सबसे कम एकाग्रता TNF-α 17 एमएफआई के एक स्वीकार्य प्रतिक्रिया का उत्पादन किया है, सबसे कम एकाग्रता TNF-α की प्रतिक्रिया से अधिक से अधिक तीन बार मानक विचलन. (10 एमएफआई + (2,4) 3 = 16,29 एमएफआई) इसी प्रकार, अनुसंधान एवं विकास सिस्टम DuoSet एलिसा के लिए पता लगाने की सीमा 63 स्नातकोत्तर / एमएल और 31 स्नातकोत्तर / एमएल (तालिका 1) के बीच होने का अनुमान था. <p claएस एस = "jove_content"> चित्रा 1. चार पर कब्जा एंटीबॉडी के हर संभव संयोजन के लिए अनुसंधान एवं विकास प्रणाली (2,000 स्नातकोत्तर / एमएल) मानक (चार अलग अलग microsphere क्षेत्रों को मिलकर) और चार का पता लगाने के एंटीबॉडी के बीच प्रतिदीप्ति तीव्रता (एमएफआई). यहाँ क्लिक करें बड़ा देखने के लिए आंकड़ा . चित्रा 2. चार पर कब्जा है और पता लगाने के एंटीबॉडी जोड़ी संयोजन के लिए तीन अलग अलग पुनः संयोजक मानकों (1,000 स्नातकोत्तर / एमएल) की ऑप्टिकल घनत्व (ओवर ड्राफ्ट). पर कब्जा है और पता लगाने के एंटीबॉडी विक्रेता द्वारा मनमाने ढंग से रखा गया, सादगी के लिए. बड़ा आंकड़ा देखने के लिए यहाँ क्लिक करें . <tdcolspan = "4"> अनुसंधान एवं विकास सिस्टम DuoSet / स्नातकोत्तर एमएल है आयुध डिपो एसटीडी देव 3 एसडी 1000 2.084 0.035 2.187 500 1.328 0.038 1.441 250 0.787 0.025 0.863 125 0.476 0.026 0.554 63 0.304 0.023 0.374 31.3 0.212 0.025 0.287 15.6 0.167 <tघ> 0.026 0.244 0 0.118 0.021 0.182 तालिका 1 2 गुना कमजोर पड़ने अनुसंधान एवं विकास सिस्टम एक मानक वक्र के रूप में उपयोग के लिए DuoSet पैकेज डालने, द्वारा निर्दिष्ट श्रृंखला के ऑप्टिकल घनत्व (ओवर ड्राफ्ट), मानक विचलन (एसडी) और पता लगाने के अनुमानित सीमा (लोद) सहित 31.3 के बीच, स्नातकोत्तर / एमएल और 63 स्नातकोत्तर / एमएल. अनुसंधान एवं विकास सिस्टम पर कब्जा है और एंटीबॉडी जांच / स्नातकोत्तर एमएल है एमएफआई एसटीडी देव 3 एसडी 8000 20,320 463 </tघ> 21,707 4000 15,594 223 16,263 2000 11,098 79 11,336 1000 6985 160 7465 500 +४१४९ 80 4390 250 2233 30.0 2323 125 १,१९९ 43.8 1330 63 636 14.0 678 31.3 340 12.9 379 <s> trong 15.6 183 5.9 201 7.8 103 2.2 109 3.9 66 2.4 73 0 11 0.8 13.8 टेबल 2 एक मानक कमजोर पड़ने Xmap प्रौद्योगिकी द्वारा मापा श्रृंखला के औसत प्रतिदीप्ति (एमएफआई) तीव्रता, एंटीबॉडी के साथ अनुसंधान एवं विकास सिस्टम DuoSet शामिल जोड़ी का उपयोग, मानक विचलन (एसडी) और पता लगाने की अनुमानित सीमा (लोद), 3.91 से कम / स्नातकोत्तर एमएल है. आर एंड डी Millipore डिटेक्शन अब के साथ सिस्टम पर कब्जा अब / स्नातकोत्तर एमएल है एमएफआई <strong> एसटीडी देव 3 एसडी 8000 ५,८०० 143 6229 4000 3881 120 +४,२४२ 2000 2176 73 २,३९६ 1000 +११३८ 32.1 1234 500 578 31.3 671 250 289 6.2 307 125 142 3.1 151 63 75 5.3 91 31.3 44 3.3 54 15.6 28 2.6 35.5 7.8 17 1.5 21.2 3.9 10 2.0 16.3 0 7 1.4 11.4 तालिका 3 एक मानक कमजोर पड़ने Xmap प्रौद्योगिकी द्वारा मापा श्रृंखला के औसत प्रतिदीप्ति (एमएफआई) तीव्रता, अनुसंधान एवं विकास सिस्टम पर कब्जा एंटीबॉडी और ईएमडी Millipore का पता लगाने के एंटीबॉडी का उपयोग करते हुए, मानक विचलन (एसडी) और पता लगाने की अनुमानित सीमा (लोद) सहित, कम 7.81 से स्नातकोत्तर / एमएल. <img alt="चित्रा 3" src="/files/ftp_upload/4084/4084fig3.jpg"/> चित्रा 3. दो Xmap assays के और आर एंड डी सिस्टम DuoSet एलिसा के मानक घटता है. बड़ा आंकड़ा देखने के लिए यहाँ क्लिक करें . चित्रा 4 Xmap मानक घटता है और लॉग इन लॉग पैमाने में एलिसा मानक वक्र की तुलना. बड़ा आंकड़ा देखने के लिए यहाँ क्लिक करें .

Discussion

एलिसा परख के Luminex Xmap मंच के रूपांतरण के है streptavidin phycoerythrin (SA पीई) के साथ एक ठेठ एलिसा किट में streptavidin हॉर्सरैडिश peroxidase (एसए एचआरपी) प्रतिस्थापन, और प्रदर्शन के लिए अनुकूलित के रूप में सरल किया जा सकता है. उन लोगों के लिए जो भूमि ऊपर से एक Xmap immunoassay बनाना चाहते हैं, यह एक सरल प्रोटोकॉल है कि यह भी तेजी से, प्रतिरक्षी जोड़े के मल्टीप्लेक्स मूल्यांकन के लिए सक्षम बनाता है के साथ पूरा किया जा सकता है. Xmap परख के लिए अभिकर्मकों आसानी Xmap एंटीबॉडी युग्मन किट का उपयोग कर नामित कब्जा एंटीबॉडी जोड़े को MagPlex कम एकाग्रता की microspheres के लिए तैयार थे. कम एकाग्रता microspheres के उपयोग उच्च एकाग्रता microspheres की ही परख प्रदर्शन प्रदान करते हुए परख विकास की लागत कम कर देता है. समय की राशि के लिए मिलकर MagPlex microspheres तैयार करने की आवश्यकता लगभग 3 घंटे है, जो बहुत तेजी से 22 से 24 घंटे एक एलिसा थाली का अच्छी तरह से कोट करने के लिए आवश्यक उपचार के बादलेपित कुओं की. Xmap परख का प्रदर्शन भी पता लगाने की सीमा (<4 स्नातकोत्तर / एमएल बनाम> 31 / स्नातकोत्तर एमएल) और गतिशील श्रेणी (<4 स्नातकोत्तर एमएल /> 8000 / स्नातकोत्तर एमएल 16 बनाम के रूप में एलिसा से बेहतर है स्नातकोत्तर एमएल / 1000 स्नातकोत्तर / एमएल). प्लेट पाठकों को एक सीमित आयुध डिपो रेंज है जो या तो 3 या 4 आयुध डिपो, एक परख के लिए गतिशील रेंज की ऊपरी सीमा सीमित है.

बेशक, नहीं सभी एंटीबॉडी एलिसा प्रारूप में काम और एंटीबॉडी कि एक एलिसा में अच्छी तरह से काम नहीं को Xmap परख प्रारूप करने के लिए आसानी से हस्तांतरणीय हैं. हालांकि, बाद से Xmap assays के (यानी, एक साथ चलाने के) में मल्टिप्लेक्स जा सकता है, यह संभव है कई को पकड़ने और पहचान प्रतिरक्षी संयोजन समवर्ती मूल्यांकन करने के लिए सबसे अच्छी जोड़ी की पहचान के लिए एक परख के लिए उपयोग. इस प्रक्रिया में महत्वपूर्ण समय और एलिसा विकास प्रक्रिया, जो एक समय में एक जोड़ी के मूल्यांकन के लिए सीमित है के लिए की तुलना में अभिकर्मकों बचाता है. दो या अधिक एंटीबॉडी जोड़े यों प्रदर्शन करना चाहिए, परख की अन्य पैरामीटर कर सकते हैंजोड़ी (उदाहरण के लिए, उपलब्धता, लागत, आदि) की उपयुक्तता का निर्धारण करने के लिए माना जाता है.

सुधार परख और Xmap परख के साथ प्रदर्शन लचीलापन के अलावा, वहाँ भी महत्वपूर्ण लागत बचत कर रहे हैं. एंटीबॉडी की सिफारिश की मात्रा एक एकल अच्छी तरह से एक एलिसा थाली 400ng है कोट करने के लिए आवश्यक है, जबकि एक Xmap परख की अच्छी तरह से एक में इस्तेमाल किया मोती के लिए आवश्यक मात्रा लगभग 7.5 एनजी है. इस प्रकार, एंटीबॉडी की राशि एक एलिसा के लिए आवश्यक अच्छी तरह से 50 से अधिक परीक्षण के परिणाम प्रदान करते हैं, अगर Xmap परख में इस्तेमाल किया जाएगा. अनमोल नमूनों को शामिल अनुप्रयोगों के लिए, Xmap भी एक महत्वपूर्ण लाभ है. नमूना एलिसा के लिए सिफारिश की मात्रा 100 μL है जबकि Xmap परख के लिए आवश्यक मात्रा में है कि आधे, या कम किया जा सकता है.

सारांश में, एक एलिसा परख की Luminex Xmap मंच रूपांतरण सीधी, कुशल और लागत बचत है, जबकि श्रेष्ठ गतिशील रेंज और संवेदनशीलता के साथ एक परख का निर्माण.

Materials

Description	Vendor	Catalogue Number	Comments
Human TNF-α/TNFSF1A DuoSet ELISA kit	R & D Systems	DY210	Includes monoclonal and biotin coupled polyclonal antibodies and recombinant TNF-α protein standard
Monoclonal Antibody to TNF-α	Abcam	Ab18696	Capture Antibody, clone CH8820
Monoclonal Antibody to TNF-α	Abcam	Ab16166	Biotin coupled Detection Antibody, clone AS1
TNF alpha protein	Abcam	Ab9642	Recombinant TNF-α protein standard
Monoclonal Antibody to TNF-α	Novus	NBP1-50115	Capture Antibody, clone 4H31
Monoclonal Antibody to TNF-α	Novus	NB100-78162	Biotin coupled Detection Antibody, clone MAb11
TNF alpha protein	Novus	NBC1-18460	Recombinant TNF-α protein standard
Monoclonal Antibody to TNF-α	EMD Millipore	MAB1141	Capture Antibody, clone 3C7.2
Polyclonal Antibody to TNF-α	EMD Millipore	654250	Rabbit polyclonal Detection Antibody
Streptavidin-Phycoerythrin	Moss	SAPE-001	Fluorescent reporter reagent for Luminex xMAP Assay
MAGPIX w/ xPONENT Software	Luminex Corporation	MAGPIX-XPONENT	Luminex Instrument
xMAP Antibody Coupling (AbC) Kit	Luminex Corporation	40-50016	Includes EDC reagent, Sulfo-NHS reagent, activation buffer, wash buffer, 1.5 mL reaction tubes, and disposable pipettes
MagPlex Microspheres, Low Concentration	Luminex Corporation	MC10012-ID, MC10013-ID, MC10014-ID, MC10015-ID	Low concentration beads (@ 2.5 x 106 bead/mL)
EZ-Link Sulfo-NHS-LC-Biotin	Thermo Fisher	PI-21335	Biotinylation kit for unmodified detection antibody
Tecan Infinite F200 Reader	Tecan		ELISA plate reader
Phosphate Buffered Saline	Sigma-Aldrich	P-3688	1% PBS-BSA, Assay Buffer
One-Pint Compact Ultrasonic Cleaner, 115 VAC	Cole-Parmer	WU-08849-00	Produce an effective operating frequency of 55 kHz
Magnetic Tube Separator	Luminex Corporation	CN-0288-01	For single 1.5mL tube magnetic separation in coupling wash steps
Magnetic Plate Separator	Luminex Corporation	CN-0269-01	For 96-well plate magnetic separation in assay wash steps