Summary
ELISA ניתן להמיר בקלות assay Luminex Xmap, ובאמצעות היתרונות של נוגדנים, ריבוב כמה יכול להיות מוקרן בו זמנית לזהות נוגדנים זוג אופטימלי, והתוצאה היא רגישות מוגברת טווח דינמי, תוך הפחתת עלות assay.
Abstract
Assay האנזים צמוד immunosorbent (ELISA) כבר זמן רב את הכלי העיקרי לגילוי של analytes של עניין דגימות ביולוגיות הן למחקר מדעי החיים ודיאגנוסטיקה קלינית. עם זאת, ELISA יש מגבלות. הדבר מתבצע בדרך כלל microplate 96-היטב, בארות מכוסים נוגדנים ללכוד, הדורש כמות גדולה יחסית של המדגם לתפוס אנטיגן של עניין. שטח פנים גדול של בארות מחייב הידרופובי של נוגדנים ללכוד יכול להוביל גם הרקע הלא ספציפית מחייב יותר. בנוסף, רוב ELISAs להסתמך על הגברה האנזים בתיווך של אות על מנת להשיג רגישות סבירה. הגברה כזו היא לא תמיד ליניארית תוצאות ולכן ניתן ליצור הטיה.
ב -15 השנים האחרונות, התפתחה טכנולוגיה חדשה המציעה את היתרונות של ELISA, אך גם מאפשר קצב העברת נתונים גבוהה יותר, גמישות משופרת, נפח דגימה מופחת, ובעלות נמוכה יותר, עם וו דומהrkflow 1, 2. Luminex Xmap הטכנולוגיה היא (חרוז) microsphere מערך פלטפורמה המאפשרת הן monoplex ואת מבחני זמנית כי ניתן להחיל את החלבון הן חומצות גרעין ויישומים 3-5. החרוזים יש נוגדנים ללכוד משותקת קוולנטית על שטח פנים קטן יותר, המחייב נוגדנים ללכוד פחות כרכים מדגם קטן יותר, בהשוואה ל ELISA, ולא ספציפית מחייב מצטמצם משמעותית. כרכים מדגם קטנים יותר חשובים בעבודה עם דגימות מגבילות כמו הנוזל השדרתי, נוזל סינוביאלי, וכו '6. ריבוב assay תצמצם עוד יותר את נפח דרישות לדוגמה, המאפשר מספר רב של תוצאות ממדגם אחד.
שיפורים שנעשו לאחרונה על ידי Luminex כוללים: המערכת החדשה MAGPIX, קטן יותר, זול יותר, קל יותר לשימוש Analyzer, ריכוז נמוך מגנטי MagPlex microspheres אשר מבטל את הצורך צלחות הסינון יקרים לבוא בריכוז עובד מתאים יותר לפיתוח assay ונמוך התפוקה יישומים וכן את הצימוד נוגדן Xmap (ABC) קיט, הכולל פרוטוקול, חומרים כימיים, וחומרים מתכלים הדרושים צימוד חרוזים כדי נוגדנים לכידתו של עניין. (ראה סעיף חומרים לרשימה מפורטת של תכולת הערכה).
בניסוי זה, אנו ממירים את assay מראש אופטימיזציה ELISA עבור ציטוקינים TNF-alpha לפלטפורמה Xmap ולהשוות את הביצועים של שתי השיטות 7-11. TNF-alpha הוא סמן ביולוגי המשמש למדידת תגובות דלקתיות בחולים עם מחלות אוטואימוניות.
נתחיל צימוד ללכוד ארבעה נוגדנים מועמד ארבע קבוצות microsphere או אזורים שונים. כאשר מערבבים יחד, אלה ארבע קבוצות לאפשר בדיקות סימולטני של כל ארבעת המועמדים עם ארבעה נוגדנים זיהוי נפרדים כדי לקבוע זוג נוגדנים הטובה ביותר, ריאגנטים חיסכון, מדגם וזמן. שני מבחני Xmap בנויים כך עם שני זוגות נוגדנים האופטימלית ביותר והביצועים שלהםבהשוואה לזו של assay ELISA המקורי לגבי עוצמת האות, טווח דינמי, ורגישות.
Protocol
I. הכנה מגיב
- נוגדנים בחירה הכנה
- זיהוי נוגדנים שישמשו בניסוי.
- ארבעה ללכוד נוגדנים ספציפיים עבור האדם: TNF-אלפא, אם חד שבטי או polyclonal, כל המינים המארחות אותם.
- ארבעה זיהוי נוגדנים ספציפיים עבור האדם: TNF-אלפא, ללא שינוי או כך, biotinylated או PE-מצומדות.
- אחת נוגדנים אישור: PE-מצומדות וספציפי עבור המין המארחות של נוגדנים ללכוד.
- מחדש את כל הנוגדנים על היצרן המומלץ על ריכוזי עובדים.
- בחר ארבע צלוחיות של ריכוז נמוך MagPlex microsphere (חרוז) קבוצות או אזורים, למשל, מספרים Luminex חלק MC10012-ID, MC10013-ID, MC10014-ID, ו MC10015-ID.
- זיהוי נוגדנים שישמשו בניסוי.
- צימוד נוגדנים MagPlex microspheres, באמצעות נוגדן Xmap (ABC) Coupling Kit
מחדשfer למצב ידני משתמש קיט של ABC (חלק # 89-00002-00-319) עבור ההליך צימוד שלם. (הערה: microspheres רגיש צריך להיות מוגן מפני האור בכל הזדמנות אפשרית.)- להביא את ריאגנטים של ערכת ה-ABC לטמפרטורת החדר וארבעה תווית צינורות תגובה עם המספרים האזור חרוזים שנבחרו תגובת צימוד. להעביר את התוכן של ארבע צלוחיות של חרוזים MagPlex (1 מ"ל כל אחד או 2.5 x 10 6 חרוזים) לתוך צינורות ארבעה התגובה שכותרתו.
- לשטוף כל אחד מגדיר חרוז פעמיים μL 500 של מאגר ההפעלה, כמתואר ערכת ABC ידני.
- להפעיל את כל קבוצה עם חרוז μL 480 מתוך חוצץ ההפעלה, 10 μL של Sulfo-NHS, ו 10 μL של מגיב EDC, על פי נוהל של ערכת ABC ידני ולאחר דגירה של 20 דקות. (הערה:. מגיב EDC יש μL מחדש בשנת 250 לפני הפעלת מאגר מיד לשלב זה)
- חזור על השלב הקודם עם לשטוף עכשיו "מופעל" microspheres כולל של thrפעמים ee עם μL 500 של מאגר ההפעלה, כמתואר במדריך ABC קיט.
- הכינו ארבעה פתרונות נפרדים, שכל אחד המכיל 7.5 מיקרוגרם (כלומר, 3 מיקרוגרם / מיליון microspheres) של נוגדן לכידת במאגר ההפעלה.
- הוספת נוגדנים אלה ארבעה פתרונות לכידת לצינורות המתאימים התגובה, מערבולת כל צינור מיד, דגירה במשך שעתיים על הכתף.
- חזור על השלב הקודם עם לשטוף עכשיו "יחד" microspheres בסך הכל שלוש פעמים עם 500 μL של למאגר Wash כלל עם ערכת ה-ABC.
- לאחר שלב הגמר לשטוף, להוסיף 500 מאגר Wash μL לצינור כל תגובה על מנת לספק ריכוז המניות הסופי של 5 מיליון נוגדנים מצמידים חרוזים למיליליטר. מערבולת ו sonicate צינורות התגובה לפזר microspheres.
הערה: הצללה חלקית את הבקבוקון microsphere סגור שואב קולי מלא במים DI מספק sonication יעיל בכל האמצעים לשטוף. (ראה טבלה חומרים עבור הודעות דוארquipment פרטים). - אחסן את החרוזים יחד ב 2-8 מעלות צלזיוס ומוגן מפני אור עד הצורך.
- ספירת מצמידים microspheres
- לספור את מספר microspheres התאושש לאחר תגובת צימוד באמצעות מונה התא או hemacytometer. עיינו במדריך למשתמש של מכשיר של סופר לקבלת הוראות מתאימות על כך. ההתאוששות מן תגובת צימוד הוא בדרך כלל מעל 90%.
- צימוד אישור
- אשר את תגובת צימוד הצליחה בהכנת פתרונות בדיקה של המניות חרוזים יחד עבור כל קבוצה, עם הריכוז הסופי של 100 חרוזים / μL במאגר Assay (PBS עם BSA 1%). הכן דילולים של phycoerythrin-(PE-) נוגדן הנקרא IgG נגד מינים אישור על 4 מיקרוגרם / מ"ל במאגר Assay.
- 50 aliquot μL של כל פתרון מבחן לארבעה בארות של צלחת עגולה התחתונה 96-ובכן,, עבור סכום כולל של 16 בארות. לאחר מכן להוסיף 50 μL של מאגר Assay תוך 8 של ולס, למדוד רקע, ו 50 μL של נוגדנים אישור בדילול מלא לתוך שמונה בארות הנותרים.
- מערבבים בעדינות את התגובות של pipetting מעלה ומטה מספר פעמים עם pipettor הרב ערוצית. מכסים את הצלחת, ואת דגירה במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר על שייקר צלחת.
- מניחים את הצלחת על צלחת מפריד מגנטי של 1-2 דקות למשוך את החרוזים מן הפתרון. לאחר מכן, להסיר את הנוזל על ידי צלחת היפוך בכוח, תוך כדי הפרדה, על קיבול בזבוז.
- לשטוף היטב פעמיים זה על ידי הוספת 100 μL של מאגר Assay והסרה supernatant מהצלחת באופן דומה באמצעות מפריד צלחת מגנטית.
- Resuspend את החרוזים ב μL 100 של מאגר Assay ידי pipetting בעדינות מעלה ומטה חמש פעמים עם pipettor הרב ערוצית.
- ניתוח על מכשיר Luminex Xmap, כגון כלי MAGPIX. עוצמת האות ניאון של התגובה הזו היא directlביחס y לכמות החלבון על פני השטח של החרוזים, מתן הערכה מהירה של כמות יחסית של חלבון מצמידים את החרוזים.
- צימוד ביוטין נוגדנים ללא שינוי על איתור
- אם באמצעות זיהוי נוגדנים ללא שינוי, biotinylate אלה נוגדנים עם מגיב פישר תרמו Sulfo-NHS-LC-ביוטין EZ-Link (קט 'מס' PI-21335) ואת ההליך המתואר בעלון את החבילה. Biotinylated פעם, הנוגדנים לזיהוי מאוחר יותר יכול להיות מתויג עם streptavidin phycoerythrin (SA-PE) ב assay (שלב III.6.), כך שהם יכולים להיות מזוהים עם נתח Xmap.
השנייה. Assay ההתקנה
- להכין תערובת הראשונית של כל ארבעת קבוצות החרוזים על ידי הוספת 10 μL של כל mL 0.96 של PBS עם BSA 1% (Buffer Assay. ראה טבלה חומרים) כדי לקבוע איזה הוא היעיל ביותר עם Assay Xmap.
- להכין את הנוגדן פתרונות זיהוי על ידי דילuting כל 1 מיקרוגרם / מ"ל במאגר Assay.
- הכן מו"פ מערכות TNF-α תקן חלבון 2000 pg / mL במאגר Assay.
- לדלל את streptavidin-rPhycoerythrin (SA-PE) (בתנאי @ 1 מ"ג / מ"ל) עד 8 מיקרוגרם / מ"ל במאגר Assay.
ג. נוגדנים הקרנה
- הוסף 50 μL של תערובת נוגדנים מצמידים microsphere לכל אחד 16 בארות של צלחת עגולה התחתונה 96-גם שחקן המשנה עבור assay ההקרנה.
- הוסף 50 μL מאגר Assay עד 8 מתוך 16 בארות, כדי למדוד את הרקע.
- הוסף 50 μL של R & D מערכות TNF-α סטנדרטי (@ 2000 pg / ml) על 8 בארות נוספות, כדי למדוד את התגובה.
- דגירה למשך שעה בטמפרטורת החדר, מפני האור, בעוד רועד על הצלחת assay שאכר.
- הוסף 50 μL של כל אחד מארבעת זיהוי נוגדנים לארבעה בארות (2 רקע 2 תגובה) ו דגירה במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר, המוגנות מפני האור, בעוד רועד על הצלחת assay שאKer.
- הוסף 50 μL של מגיב SA-PE לכל בארות דגירה 15 דקות בטמפרטורת החדר, מפני האור, בעוד רועד על הצלחת assay שאכר.
- מניחים את הצלחת על צלחת מפריד מגנטי למשך דקה אחת ולאחר מכן להסיר את הנוזל על ידי צלחת היפוך בכוח.
- הוספת 100 מאגר Assay μL לכל אחד 16 בארות, הנח את הצלחת על צלחת מפריד מגנטי למשך דקה אחת ולאחר מכן להסיר את הנוזל על ידי צלחת היפוך בכוח תוך כדי הפרדה.
- הוספת 100 μL של מאגר Assay לכל אחד 16 בארות ולקרוא את הצלחת עם המכשיר Luminex MAGPIX, בהתייחסו במדריך למשתמש של שימוש תקין.
- בחר זוג נוגדנים העונה עוצמת האות הרצוי.
IV. Xmap פונקציונלית Assay
- לאחר בחירת נוגדנים ללכוד הטובה ביותר, לדלל 100 μL של מניות חרוז נוגדנים מצמידים (משלב IB8) ל 10 מ"ל עם מאגר Assay.
- הוסף 50 μL שלאת החרוזים מדולל ל -78 בארות של שני שחקן המשנה מסביב התחתון 96-גם הצלחות. (78 בארות x 2 פלטות = 156 בארות) כל צלחת ישמש כדי להעריך את הביצועים של נוגדנים זיהוי אחר.
- הכן עקומת 12 נקודות בתקן, החל 8000 pg / mL וכלה ב 4 pg / mL, עם R & D מערכות TNF-α סטנדרטי. להוסיף 6 50 μL משכפל של דילול כל לכל אחד הצלחות, בתוספת שש בארות עם μL 50 של מאגר Assay זה, כרקע, על סך של 78 בארות / צלחת.
- דגירה הצלחות במשך שעה בטמפרטורת החדר, מפני האור, בעוד רועד על הצלחת assay שאכר.
- הוסף 50 μL של נוגדנים זיהוי 1 לכל 78 בארות של הצלחת הראשונה. חזור על נוגדנים זיהוי 2 על הצלחת 2.
- דגירה הצלחות במשך 30 דקות, בטמפרטורת החדר, מפני אור בזמן לוחץ על צלחת assay שאכר.
- הוסף μL 50 של מגיב SA-PE לכל הבארות של כל צלחת.
- לדגורשתי צלחות במשך 15 דקות, בטמפרטורת החדר, מפני אור בזמן רועד על הצלחת assay שאכר.
- מניחים את הצלחות על מפרידי צלחת מגנטיים למשך דקה אחת, ולאחר מכן להסיר את הנוזל על ידי צלחת היפוך בכוח תוך כדי הפרדה.
- הוספת 100 μL של מאגר Assay לכל אחד 78 בארות על הצלחות, למקם את הצלחות על מפרידי צלחת מגנטיים למשך דקה אחת, ולאחר מכן להסיר את הנוזל על ידי צלחת היפוך בכוח.
- הוספת 100 μL של מאגר Assay לכל אחד 78 בארות על הצלחות ולנתח על המכשיר MAGPIX, בהתייחסו במדריך למשתמש של שימוש תקין.
ו 'ELISA Assay
- ההוראות הכלולות ב-R & D מערכות אנושיות TNF-α/TNFSF1A DuoSet ערכת ELISA (מו"פ חלק # DY210), למדוד את התגובה שנוצר על ידי תקן המסופק עם ערכת ה-R & D. חזור על assay ELISA שלוש פעמים נוספות, החלפת מו"פ מערכות ללכוד זיהוי נמלהibodies עם נוגדנים של ספקים אחרים. זוג הפשטות, את הנוגדנים על ידי הספק (למשל, נוגדנים Millipore ללכוד עם נוגדן איתור Millipore, נוגדנים Abcam ללכוד עם נוגדן איתור Abcam וכו ').
- להעריך כל זוג בנפרד, כנדרש על פי הפורמט ELISA, עם כל אחד משלושת TNF-אלפא סטנדרטים חלבון.
VI. נציג תוצאות
פרוטוקול זה מדגים כיצד ELISA טיפוסי ניתן להמיר פלטפורמת Xmap תוך ניצול יכולת זמנית של הטכנולוגיה במהירות כדי לייעל את assay. ELISA להשתמש בדוגמה זו היה נמק הגידול האנושי גורם אלפא (TNF-α) DuoSet ערכת ELISA של מו"פ מערכות (מו"פ חלק # DY210).
בנוסף זוג נוגדנים המסופק בערכה, שלושה זוגות נוגדנים אחרים ממקורות שונים (ראו טבלת חומרים) הוערכו בו זמנית באמצעות פלטפורמת Xmap. FOur של נוגדנים היו יועד נוגדנים ללכוד היו מצמידים את MagPlex ריכוז microspheres נמוכה. שאר ארבעת נוגדנים נועדו כמו זיהוי נוגדנים, שלושה מהם נרכשו כמו ביוטין מצמידים ו 4 היה biotinylated כמפורט בפרוטוקול.
הנוגדנים עבור מחקר זה נבחרו על בסיס מקום פנוי של ספקי. עם זאת, על רקע מעשי, נוגדנים יש לבחור על פי העדפת המשתמש של הפרט וניסיון ביצועי העבר עם נוגדן. אם כי, הניסוי הזה אינו בודק את התאמתם של נוגדן כמו נוגדנים ללכוד לעומת זיהוי נוגדנים, פרוטוקול זה ניתן לשנות בקלות למטרה זו.
Xmap מבחני Luminex בוצעו גם זמנית כדי להעריך את כל הנוגדנים ללכוד ארבעה כתערובת, על ידי שילוב של ארבעה סטים של TNF-α נוגדנים מצמידים MagPlex microspheres. הנוגדנים ללכוד הוערכו עם כל אחד 4גילוי נוגדנים biotinylated באופן אישי, כך את האינטראקציה של הנוגדן 1 זיהוי עם כל אחד מארבעת נוגדנים ללכוד ניתן לקבוע בו זמנית. ארבעה מבחני כאלה, שבוצעו במקביל, קבעו את יחסי הגומלין של כל ארבעת זיהוי נוגדנים עם כל ארבעת נוגדנים ללכוד. איור 1 מציג את הנתונים ההשוואתיים של אלה מבחני המיון.
התוצאות הצביעו על כך זוג נוגדנים מ R & D מערכות DuoSet הביצועים הטובים ביותר עם התגובה וכתוצאה מכך בעוצמה 6183 פלואורסצנטי (MFI) יחידות חציון. זה היה ציין גם כי נוגדנים זיהוי של Millipore (86% של התגובה מו"פ זוג נוגדנים) ו Abcam (67%) סיפקו מענה סביר assay Xmap, בשילוב עם נוגדנים מערכות מו"פ ללכוד. את הנוגדנים ללכוד Abcam, Millipore ו נובוס המיוצר תגובה רצויה פחות assay Xmap.
חשוב לציין, כי פורפוזה של מחקר זה היא לאו דווקא כדי להדגיש את ההבדלים בין נוגדנים או לספקים מסוימים, אבל רק כדי להמחיש כי יש הבדלים לצפייה בביצועים שלהם כאשר השתמשו בתנאים דומים, וכי הפלטפורמה Xmap יכולים להציע אמצעי יעיל להערכת ההבדלים הללו.
R & D מערכות DuoSet פרוטוקול שימש להשוות בין זוגות נוגדנים ארבעה בפורמט ELISA. R & D מערכות הפרוטוקול שימש עם כל זוגות נוגדנים משום שהוא משקף את טיפוסי פרוטוקולים אליסה בשימוש נרחב היום וזה מקביל פרוטוקולים בשימוש בטכנולוגיה Xmap. הבדיקות הראו כי אליסה זוג נוגדנים מ R & D מערכות שוב נתן את התוצאות הטובות ביותר (איור 2). זוג נוגדן המיוצר מ Abcam תשובה ואת זוגות נוגדנים מן התגובות Millipore ו נובוס צנועים המיוצרים.
על מנת להעריך את כל וריאציה תגובתיות נוגדנים עם תקן, כל antibod 4זוגות-y נבדקו שלושה שונות TNF-אלפא סטנדרטים רקומביננטי חלבון, משלושה ספקים שונים (ראו טבלת חומרים). הנתונים הצג איור 2 כי רקומביננטי TNF-אלפא סטנדרטים חלבון משלושת ספקי נתן תוצאות מקבילים.
חלבון TNF-α מ R & D מערכות נעשה שימוש כדי ליצור עקומות סטנדרטיות עם ELISA (טבלה 1) ואת מבחני Xmap (לוחות 2 ו -3). בעוד assay ELISA נעשה עם זוג מערכות מחקר ופיתוח נוגדנים, מבחני Xmap מנוצל מו"פ מערכות נוגדנים ללכוד גם את הנוגדנים לזיהוי מ R & D מערכות או Millipore. חלבון TNF-α מ R & D מערכות דוללה לייצר מגוון רחב של ריכוזים מ 8000 עד עמ '4 / mL. רק זוג נוגדנים מ R & D מערכות הפיק את התוצאה הצפויה assay Xmap, עם תגובה> 20000 MFI, כפי שניתן לראות בטבלה 2 ואיור 3. כאשר הנוגדנים לזיהוי מ Millipore שימש עם Assay Xmap במקום נוגדנים מערכות מו"פ איתור (לוח 3), התגובה (6000 MFI) היה כ -30% בתגובה שהושג עם הנוגדן זיהוי מ R & D מערכות, כפי שמוצג איור 3.
מנתוני לוח 1 מייצג את עקומת רמת ELISA, אשר המליצה של היצרן TNF-α מגוון PG 16-1000 / mL. טווח זה היה מוגבל מאוד, כי OD ב 1000 היה pg / mL מעט יותר מ -2 יחידות OD ו ספקטרופוטומטר אינו מסוגל למדוד מעל 3 OD. בגלל מגבלת עם ספקטרופוטומטר, לא ניתן היה להגדיל את טווח assay ELISA נוסף. בנוסף, הנתונים בטבלה 1 מצביעים על R & D מערכות DuoSet ELISA אינו מסוגל לאתר TNF-α בריכוזים הרבה פחות מ 16 pg / mL. מצד שני, assay Xmap מסוגל measuring TNF-α בריכוז של פחות מ 7.8 pg / mL עם נוגדנים ללכוד מ R & D מערכות בשילוב עם נוגדנים או זיהוי של מערכות המחקר והפיתוח או Millipore.
טווח רגישות דינמית של שתי השיטות באה לידי ביטוי טוב יותר כאשר להתוות סולם log-log (איור 4). הבחנה ברורה בין השיפוע של התגובות ELISA ואת תשובות של מבחני Xmap ניתן לראות כי עוד מציין יכולת יותר ובכך מגבילים לגילוי של TNF-α עם ELISA, בשני ריכוזים גבוהים או נמוכים יותר.
מגבלות של גילוי (לוד) עבור שתי TNF-אלפא מבחני תפקודית Xmap היו מקורב על ידי זיהוי הנמוך ביותר TNF-α ריכוז ברמה בתגובה ציין (MFI) עולה על רקע, ועוד שלוש פעמים סטיית התקן שלו (SD). כדי להשיג מובהקות סטטיסטית, 6 משכפל שימשו כדי לקבוע SD עבור שתי השיטות Xmap ו ELISA. Thes הערכות אלקטרוני לוד אופטימיים ונועד לספק "במקרה הטוב ביותר," התרחיש, מתוך הבנה כי בתנאי הפעלה רגילים רק 2 או 3 משכפל ישמש. בטבלה 2, ניתן להבחין כי, כאשר באמצעות ה-R & D מערכות זוג, הנמוך ביותר TNF-α הריכוז 3.91 הפיק pg / mL התגובה של 66 MFI, שהוא גדול יותר התגובה של הרקע + 3SD, פגישה זו קריטריונים . כאשר נוגדן איתור Millipore שימש עם הנוגדן מערכות מו"פ Capture (לוח 3), גבול הגילוי היה פחות מ 7.81 pg / mL. במקרה זה, 2 הנמוך ביותר TNF-α ריכוז הפיק תגובה ראויה של 17 MFI, יותר מאשר תגובה של ריכוז TNF-α הנמוך ביותר בתוספת שלוש פעמים סטיית התקן שלה. (10 MFI + 3 (2,4) = 16,29 MFI) כמו כן, להגביל את גילוי ופיתוח מערכות DuoSet ELISA נאמד בין 63 pg / mL ו 31 pg / mL (טבלה 1).
ss = "jove_content"> 
באיור 1. עוצמת הקרינה החציונית (MFI) של ה-R & D מערכות סטנדרטיות (@ 2000 pg / mL) עבור כל שילוב אפשרי של נוגדנים ללכוד ארבעה (מצמידים את ארבעת האזורים microsphere שונים) ואת הנוגדנים לזיהוי ארבע. לחץ כאן כדי להציג גדול להבין .
איור 2. צפיפות אופטית (OD) של שלושה תקנים שונים רקומביננטי (@ 1000 pg / mL) עבור לכידת ארבעה נוגדנים לאיתור שילובים זוג. ללכוד זיהוי נוגדנים היו יחד באופן שרירותי על ידי הספק, לפשטות. לחץ כאן כדי להציג דמות גדולה .
| pg / mL | OD | Std Dev | 3 SD |
| 1000 | 2.084 | 0.035 | 2.187 |
| 500 | 1.328 | 0.038 | 1.441 |
| 250 | 0.787 | 0.025 | 0.863 |
| 125 | 0.476 | 0.026 | 0.554 |
| 63 | 0.304 | 0.023 | 0.374 |
| 31.3 | 0.212 | 0.025 | 0.287 |
| 15.6 | 0.167 | 0.244 | |
| 0 | 0.118 | 0.021 | 0.182 |
טבלה 1 צפיפות אופטית (OD) של סדרה 2 של פי הדילול שנקבע ע"י הוספה מו"פ DuoSet מערכות החבילה, לשימוש עקומת סטנדרט;. כולל סטיית תקן (SD) ואת מגבלת מוערך של זיהוי (לוד), בין 31.3 pg / mL ו 63 pg / mL.
| R & D מערכות לכידת וזיהוי נוגדנים | |||
| pg / mL | MFI | Std Dev | 3 SD |
| 8000 | 20320 | 463 21707 | |
| 4000 | 15594 | 223 | 16263 |
| 2000 | 11098 | 79 | 11336 |
| 1000 | 6985 | 160 | 7465 |
| 500 | 4149 | 80 | 4390 |
| 250 | 2233 | 30.0 | 2323 |
| 125 | 1199 | 43.8 | 1330 |
| 63 | 636 | 14.0 | 678 |
| 31.3 | 340 | 12.9 | 379 |
| 183 | 5.9 | 201 | |
| 7.8 | 103 | 2.2 | 109 |
| 3.9 | 66 | 2.4 | 73 |
| 0 | 11 | 0.8 | 13.8 |
טבלה 2 עוצמת הקרינה החציונית (MFI) של סדרת דילול תקן נמדד על ידי הטכנולוגיה Xmap, באמצעות זוג נוגדנים כלל עם R & D מערכות DuoSet:. כולל סטיית תקן (SD) לבין גבול משוער של זיהוי (לוד), פחות מ 3.91 pg / mL.
| R & D מערכות לכידת Ab עם Millipore איתור Ab | |||
| pg / mL | MFI | | 3 SD | |
| 8000 | 5800 | 143 | 6229 |
| 4000 | 3881 | 120 | 4242 |
| 2000 | 2176 | 73 | 2396 |
| 1000 | 1138 | 32.1 | 1234 |
| 500 | 578 | 31.3 | 671 |
| 250 | 289 | 6.2 | 307 |
| 125 | 142 | 3.1 | 151 |
| 63 | 75 | 5.3 | 91 |
| 31.3 | 44 | 3.3 | 54 |
| 15.6 | 28 | 2.6 | 35.5 |
| 7.8 | 17 | 1.5 | 21.2 |
| 3.9 | 10 | 2.0 | 16.3 |
| 0 | 7 | 1.4 | 11.4 |
לוח 3 עוצמת הקרינה החציונית (MFI) של סדרת דילול תקן נמדד על ידי הטכנולוגיה Xmap, באמצעות מחקר ופיתוח מערכות נוגדנים ללכוד נוגדנים Millipore EMD זיהוי:. כולל סטיית תקן (SD) לבין גבול משוער של זיהוי (לוד), פחות מ 7.81 pg / mL.
איור 3. עקומות סטנדרטיות של שני מבחני Xmap ו R & D מערכות DuoSet ELISA. לחץ כאן כדי להציג דמות גדולה .
איור 4. השוואה בין עקומות סטנדרטיות Xmap ואת עקומת סטנדרט ELISA בהיקף log-log. לחץ כאן כדי להציג דמות גדולה .
Discussion
המרה של assay ELISA לפלטפורמה Luminex Xmap יכול להיות פשוט כמו החלפת streptavidin peroxidase חזרת (SA-HRP) ב טיפוסית ערכת ELISA עם streptavidin phycoerythrin (SA-PE), ואופטימיזציה של הביצועים. למי שרוצה ליצור immunoassay Xmap מהיסוד, זה יכול להיות מושלם עם פרוטוקול ברור כי גם מאפשר הערכה מהירה, זמנית של זוגות נוגדנים. ריאגנטים לשנת assay Xmap היו מוכנים בקלות באמצעות נוגדן Xmap ערכת צימוד לזוג נוגדנים ללכוד המיועדים MagPlex microspheres ריכוז נמוך. השימוש microspheres ריכוז נמוך מפחית את העלות של פיתוח assay תוך מתן ביצועים assay אותו microspheres ריכוז גבוהה יותר. משך הזמן הנדרש כדי להכין יחד MagPlex microspheres הוא כ 3 שעות, שזה הרבה יותר מהר מאשר 22 - 24 שעות נדרש המעיל גם צלחת ELISA, ואחריו טיפולשל בארות מצופים. הביצועים של assay Xmap הוא גם עדיפה על ELISA מבחינת מגבלה של זיהוי (<4 pg / mL לעומת> 31 pg / mL) ודינמי טווח (<4 pg / mL ל> 8000 pg / mL לעומת 16 pg / mL עד 1000 pg / ml). קוראים פלייט יש מגוון מצומצם OD אשר הוא או 3 או 4 OD, להגביל את הגבול העליון של טווח דינמי assay.
אין ספק, לא כל הנוגדנים יעבדו במתכונת ELISA ולא כל הנוגדנים שפועלים היטב ב ELISA ניתנות להעברה בקלות לתבנית assay Xmap. עם זאת, מאז מבחני Xmap ניתן מרובב (כלומר, להפעיל בו זמנית), ניתן להעריך ללכוד כמה שילובים ואת הנוגדנים לזיהוי במקביל לזהות את הצמד הטוב ביותר לשימוש עבור assay. תהליך זה חוסך זמן משמעותי ריאגנטים לעומת הליך פיתוח ELISA, אשר מוגבל להערכת זוג אחד בכל פעם. שניים או יותר זוגות הנוגדנים צריך לבצע שקול, פרמטרים אחרים של assay יכוללשקול לקבוע התאמתו של זוג (למשל, זמינות, עלות וכו ').
בנוסף לביצועים assay גמישות משופרת עם assay Xmap, יש גם חיסכון משמעותי בעלויות. כמות מומלצת של נוגדנים נדרש מעיל גם יחידה של צלחת ELISA היא 400ng, בעוד הכמות הדרושה של חרוזים המשמשים 1 היטב assay Xmap הוא כ 7.5 ננוגרם. לפיכך, כמות הנוגדנים הדרוש 1 ELISA גם תספק יותר מ -50 תוצאות הבדיקה, אם נעשה שימוש assay Xmap. עבור יישומים הכוללים דגימות יקרות, Xmap יש גם יתרון משמעותי. היקף המדגם מומלץ ELISA הוא 100 μL ואילו נפח הנדרש assay Xmap יכול להיות חצי מזה, או פחות.
לסיכום, המרה של assay ELISA לפלטפורמה Luminex Xmap הוא לא מסובך, יעיל ועלות חיסכון, תוך הפקת assay עם טווח דינמי רגישות מעולה.
Disclosures
עבודה זו נעשתה על Luminex חברת הציוד מיוצרים ב Luminex Corporation.
R & D מערכות & EMD Millipore הם שותפים אסטרטגיים של Luminex Corporation; רישיון לפתח ולמסחר Xmap זמנית מבחני מבוסס.
Acknowledgments
עבודה זו מומנה על ידי Luminex Corporation.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Human TNF-α/TNFSF1A DuoSet ELISA kit | R D Systems | DY210 | Includes monoclonal and biotin coupled polyclonal antibodies and recombinant TNF-α protein standard |
| Monoclonal Antibody to TNF-α | Abcam | Ab18696 | Capture Antibody, clone CH8820 |
| Monoclonal Antibody to TNF-α | Abcam | Ab16166 | Biotin coupled Detection Antibody, clone AS1 |
| TNF alpha protein | Abcam | Ab9642 | Recombinant TNF-α protein standard |
| Monoclonal Antibody to TNF-α | Novus | NBP1-50115 | Capture Antibody, clone 4H31 |
| Monoclonal Antibody to TNF-α | Novus | NB100-78162 | Biotin coupled Detection Antibody, clone MAb11 |
| TNF alpha protein | Novus | NBC1-18460 | Recombinant TNF-α protein standard |
| Monoclonal Antibody to TNF-α | EMD Millipore | MAB1141 | Capture Antibody, clone 3C7.2 |
| Polyclonal Antibody to TNF-α | EMD Millipore | 654250 | Rabbit polyclonal Detection Antibody |
| Streptavidin-Phyc–rythrin | Moss | SAPE-001 | Fluorescent reporter reagent for Luminex xMAP Assay |
| MAGPIX w/ xPONENT Software | Luminex Corporation | MAGPIX-XPONENT | Luminex Instrument |
| xMAP Antibody Coupling (AbC) Kit | Luminex Corporation | 40-50016 | Includes EDC reagent, Sulfo-NHS reagent, activation buffer, wash buffer, 1.5 mL reaction tubes, and disposable pipettes |
| MagPlex Microspheres, Low Concentration | Luminex Corporation | MC10012-ID, MC10013-ID, MC10014-ID, MC10015-ID | Low concentration beads (@ 2.5 x 106 bead/mL) |
| EZ-Link Sulfo-NHS-LC-Biotin | Thermo Fisher | PI-21335 | Biotinylation kit for unmodified detection antibody |
| Tecan Infinite F200 Reader | Tecan | ELISA plate reader | |
| Phosphate Buffered Saline | Sigma-Aldrich | P-3688 | 1% PBS-BSA, Assay Buffer |
| One-Pint Compact Ultrasonic Cleaner, 115 VAC | Cole-Parmer | WU-08849-00 | Produce an effective operating frequency of 55 kHz |
| Magnetic Tube Separator | Luminex Corporation | CN-0288-01 | For single 1.5mL tube magnetic separation in coupling wash steps |
| Magnetic Plate Separator | Luminex Corporation | CN-0269-01 | For 96-well plate magnetic separation in assay wash steps |
References
- Fulton, J. R., McDade, R. L., Smith, P. L., Kienker, L. J., Kettman, J. R. Advanced multiplexed analysis with the FlowMetrix system. Clinical Chemistry. 43, 1749-1756 (1997).
- Carson, R. T., Vignali, A. A. Simultaneous quantation of 15 cytokines using a multiplexed flow cytometric assay. J. Immunol. Methods. 227, 41-52 (1999).
- Peck, D., Crawford, E. D., Ross, K. N., Stegmaier, K., Golub, T. R., Lamb, J. A method for high-throughput gene expression signature analysis. Genome Biol. 7, 61 (2006).
- VanDerMeid, K. R., Su, S. P., Krenzer, K. L., Ward, K. W., Zhang, J. Z. A method to extract cytokines and matrix metalloproteinases from Schirmer strips and analyze using Luminex. Mol Vis. 17, 1056-1063 (2011).
- Liu, J., Kibiki, G., Maro, V., Maro, A., Kumburu, H., Swai, N., Taniuchi, M., Gratz, J., Toney, D., Kang, G., Houpt, E. Multiplex reverse transcription PCR Luminex assay for detection and quantitation of viral agents of gastroenteritis. J. Clin. Virol. 50, 308-313 (2011).
- de Jager, W., Prakken, B. J., Bijlsma, J., WJ Kuis, W., Rijkers, G. T. Improved multiplex immunoassay performance in human plasma and synovial fluid following removal of interfering heterophilic antibodies. J. Immunol. Methods. 300, 124-135 (2005).
- Codorean, E., Nichita, C., Albulescu, L., Raducan, E., Popescu, I. D., Lonita, A. C., Albulescu, R. Correlation of xMAP and ELISA cytokine profiles; development and validation for immunotoxicological studies in vitro. Roum. Arch. Microbiol. Immunol. 69, 3-19 (2010).
- de Jager, W., te Velthuis, H., Prakken, B. J., Kuis, W., Rijkers, G. T. Simultaneous detection of 15 human cytokines in a single sample of stimulated peripheral blood mononuclear cells. Clin. Diagn. Lab. Immunol. 10, 133-139 (2003).
- DuPont, N. C., Wang, K. H., Wadhwa, P. D., Culhane, J. F., Nelson, E. L. Validation and comparison of Luminex multiplex cytokine analysis kits with ELISA: Determinations of a panel of nine cytokines in clinical sample culture supernatants. J. Reprod. Immunol. 66, 175-191 (2005).
- Richens, J. L., Urbanowicz, R. A., Metcalf, R., Corne, J., O'Shea, P., Fairclough, L. Quantitative validation and comparison of multiplex cytokine kits. Journal of Biomolecular Screening. 15, 562-568 (2010).
- Rizzi, G., Zhang, Y. J., Latek, R., Weiner, R., Rhyne, P. W. Characterization and development of a Luminex-based assay for the detection of human IL-23. Bioanalysis. 2, 1561-1572 (2010).
