Påvisning af MicroRNA i Mikroglia af Real-time PCR i Normal CNS og under neuroinflammation
Summary
Mikroglia er bosiddende makrofager, der giver den første linje i forsvaret og immun-overvågning af det centrale nervesystem. MicroRNA er regulatoriske molekyler, som spiller en vigtig rolle i mange fysiologiske processer, herunder aktivering og differentiering af makrofager. I denne artikel beskriver vi metoden til måling af microRNA i mikroglia.
Abstract
Mikroglia er celler af myeloid herkomst, som ligger i det centrale nervesystem (CNS) 1. Disse celler spiller en vigtig rolle i sygdomme i mange sygdomme forbundet med neuroinflammation såsom dissemineret sklerose (MS) 2. Mikroglia i en normal CNS udtrykke makrofag markør CD11b og udviser en hvilende fænotype ved at udtrykke lave niveauer af aktivering markører såsom CD45. Under patologiske begivenheder i centralnervesystemet, er blevet microglia aktiveres som bestemt ved opregulering af CD45 og andre markører 3. De faktorer, der påvirker microglia fænotype og funktion i CNS er ikke godt undersøgt. MicroRNA (miRNA) er en voksende familie af konserverede molekyler (ca. 22 nukleotider lange), der er involveret i mange normale fysiologiske processer, såsom cellevækst og-differentiering 4 og patologier, såsom inflammation 5. MiRNA nedregulere ekspressionen af visse målgener ved at binde komplementære sekvenserir mRNA'er og spiller en vigtig rolle i aktiveringen af medfødte immunceller, herunder makrofager 6 og mikroglia 7. For at undersøge miRNA-medierede veje, som definerer mikroglial fænotype, biologisk funktion, og til at skelne microglia fra andre typer af makrofager, er det vigtigt at kvantitativt at vurdere ekspressionen af bestemte microRNA'er i særskilte undergrupper af CNS-resident microglia. Almindelige metoder til måling af ekspression af miRNA i CNS omfatter kvantitativ PCR fra hele neuronvæv og in situ hybridisering. Imidlertid ikke kvantitativ PCR fra hele vævshomogenat ikke tillade vurdering af ekspressionen af miRNA i microglia, som kun udgør 5-15% af cellerne i neuronalt væv. Hybridisering in situ tillader vurdering af ekspressionen af microRNA i specifikke celletyper i vævssnit, men denne metode er ikke helt kvantitativ. I denne rapport beskriver vi en kvantitativ og sensitive fremgangsmåde til påvisning af miRNA ved real-time PCR microglia isoleret fra normale CNS eller under neuroinflammation hjælp eksperimentel autoimmun encephalomyelitis (EAE), en muse-model for MS. Den beskrevne fremgangsmåde vil være nyttig til at måle niveauet af ekspression af microRNA'er i mikroglia i normale CNS eller under neuroinflammation forbundet med forskellige patologier, herunder MS, slagtilfælde, traumatisk skade, Alzheimers sygdom og hjernetumorer.
Protocol
Discussion
Nylig væsentlig interesse blev givet til microglia og involvering af disse celler i mange patologier forbundet med neuroinflammation og neurodegeneration. Desuden har rolle microRNA'er i differentieringen af immun-og cancerceller dramatisk dyrket i løbet af de sidste mange år 5,10. Vi har tidligere rapporteret rolle miR-124 i opretholdelse af ikke-aktiverede eller hvilende fænotype af mikroglia i normale CNS 7, men rollen af de andre typer microRNA'er i microglia fænotype og aktivering…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Arbejdet blev støttet af NIH R01 NS071039-01A1 forskningsbevilling.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
| 1X PBS | GIBCO | 14190 | Can be prepared from dry components in the laboratory, pH: 7.2-7.4 |
| 10X PBS | Thermo Scientific | SH30258.02 | Can be prepared from dry components in the laboratory, pH: 7.2-7.4 |
| DMEM; FBS | GBCO | 11965; 10438 | |
| miRVana kit | Invitrogen | AM1561 | |
| Percoll | Sigma | P4937-500 ml | 100 ml of 100% Percoll is prepared by mixing 10 ml of 10X PBS and 90 ml of Percoll from Sigma.
50 ml of 70% Percoll is prepared by mixing of 35 ml of 100% Percoll and 15 ml of DMEM 50 ml of 40% Percoll is prepared by mixing 20 ml of 100% Percoll and 30 ml of 1X PBS |
| MOG35-55 peptide | AnaSpec Inc | 60130-5 | |
| CFA | DIFCO | 263810 | |
| Pertussis Toxin | Sigma | P7208 | |
| FcR blocking antibodies | BD Biosciences | 553142 | Clone 2.4G2 |
| Anti-CD11b–PE mAb | BD Biosciences | 553311 | Can be used with different fluorophores (e.g. AF488) |
| Anti-CD45-APC-Cy7 mABs | Biolegend | 103116 | Can be used with different fluorophores (e.g. APC) |
| Paraformaldehyde (16%) | EMS Inc | 15710 | Dilute 1:15 in 1X PBS |
| 15% TBE-Urea Gel | Life Technologies Inc. | EC68855BOX | |
| TaqMan MicroRNA Reverse Transcription Kit | Life Technologies Inc | 4366596 | |
| TaqMan Universal PCR Master Mix | Life Technologies Inc | 4304437 | |
| TaqMan MicroRNA Assays mmu-miR-124a | Life Technologies Inc | 4427975 ID 001182 | |
| TaqMan MicroRNA Assays snoRNA-55 | Life Technologies Inc | 4427975 ID 001228 | |
| Nuclease-free water | Life Technologies Inc | AM9937 | Nuclease-free water |
| 384-well clear optical reaction plate | Life Technologies Inc. | 4309849 | Can be substituted with other plates (e.g. 96 well plate) in different real-time PCR instruments |
| Dounce homogenizer (15 ml) | Wheaton Science Products. | 358044 | Teflon/glass |
| 40 μ nylon cell strainer | Falcon | 352340 | |
| Big centrifuge | Sorval | RT 6000B | Rotor diameter 18.5 cm |
| Small centrifuge | Eppendorf | 5415 R | Rotor diameter 6.5 cm |
| Real-time PCR Instrument | Life Technologies Inc. | AB 7900 HT | Can be substituted with other instruments |
| Flow cytometer | BD Biosciencess | LSR II | Can be substituted with other instruments |
| FACS | BD Biosciences | FACSAria | Can be substituted with other instruments |
| Nanodrop spectrophotometer | Thermo Scientific | Nanodrop 1000 |
References
- Tremblay, M. E. The Role of Microglia in the Healthy Brain. J. Neurosci. 31, 16064-16069 (2011).
- Graeber, M. B., Li, W., Rodriguez, M. L. Role of microglia in CNS inflammation. FEBS Lett. , (2011).
- Ponomarev, E. D., Shriver, L. P., Maresz, K., Dittel, B. N. Microglial cell activation and proliferation precedes the onset of CNS autoimmunity. J. Neurosci. Res. 81, 374-389 (2005).
- Perruisseau-Carrier, C., Jurga, M., Forraz, N., McGuckin, C. P. miRNAs stem cell reprogramming for neuronal induction and differentiation. Mol. Neurobiol. 43, 215-227 (2011).
- McCoy, C. E. The role of miRNAs in cytokine signaling. Front Biosci. 17, 2161-2171 (2010).
- He, M., Xu, Z., Ding, T., Kuang, D. M., Zheng, L. MicroRNA-155 regulates inflammatory cytokine production in tumor-associated macrophages via targeting C/EBPbeta. Cell Mol. Immunol. 6, 343-352 (2009).
- Ponomarev, E. D., Veremeyko, T., Barteneva, N., Krichevsky, A. M., Weiner, H. L. MicroRNA-124 promotes microglia quiescence and suppresses EAE by deactivating macrophages via the C/EBP-alpha-PU.1 pathway. Nat. Med. 17, 64-70 (2011).
- Basu, S., Campbell, H. M., Dittel, B. N., Ray, A. Purification of Specific Cell Population by Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS). J. Vis. Exp. (41), e1546-3791 (2010).
- Gabriely, G. MicroRNA 21 promotes glioma invasion by targeting matrix metalloproteinase regulators. Mol. Cell Biol. 28, 5369-5380 (2008).
- Caffarelli, E., Filetici, P. Epigenetic regulation in cancer development. Front Biosci. 17, 2682-2694 (2011).
- Cardona, A. E., Huang, D., Sasse, M. E., Ransohoff, R. M. Isolation of murine microglial cells for RNA analysis or flow cytometry. Nat. Protoc. 1, 1947-1951 (2006).
- Gordon, R. A simple magnetic separation method for high-yield isolation of pure primary microglia. J. Neurosci. Methods. 194, 287-296 (2011).
- Moltzahn, F., Hunkapiller, N., Mir, A. A., Imbar, T., Blelloch, R. High Throughput MicroRNA Profiling: Optimized Multiplex qRT-PCR at Nanoliter Scale on the Fluidigm Dynamic ArrayTM IFCs. J. Vis. Exp. (54), e2552 (2011).
