Nachweis von microRNAs in Mikroglia durch Real-time PCR in Normal-und ZNS Während Neuroinflammation

Summary

Mikroglia sind Makrophagen, die die erste Linie der Verteidigung und Immunüberwachung des zentralen Nervensystems liefern. MicroRNAs sind regulatorische Moleküle, die eine wichtige Rolle spielen in vielen physiologischen Prozessen einschließlich Aktivierung und Differenzierung von Makrophagen. In diesem Artikel beschreiben wir die Methode zur Messung von Mikro-RNAs in Mikroglia.

Abstract

Mikroglia sind Zellen der myeloischen Linie, die im zentralen Nervensystem (ZNS) ¹ befinden. Diese Zellen spielen eine wichtige Rolle bei der Pathologie vieler Krankheiten, die mit Neuroinflammation wie Multiple Sklerose (MS) ² verbunden ist. Mikroglia bei einem normalen ZNS auszudrücken Makrophagen-CD11b und weisen eine Ruhestätte Phänotyp durch die Expression niedrigen Aktivierungsmarker wie CD45. Während pathologischen Prozessen im ZNS, werden Mikroglia aktiviert, bestimmt durch Hochregulation von CD45 und andere Marker ^3. Die Faktoren, die Mikroglia-Phänotyp und Funktionen im ZNS betreffen sind nicht gut untersucht. MicroRNAs (miRNAs) sind eine wachsende Familie von konservierten Molekülen (~ 22 Nukleotide lang), die in vielen normalen physiologischen Prozesse wie Zellwachstum und Differenzierung ⁴ und Krankheiten wie Entzündungen ⁵ beteiligt sind. MiRNAs herunterregulieren die Expression bestimmter Zielgenen durch Binden komplementärer Sequenzen derir mRNAs und spielen eine wichtige Rolle bei der Aktivierung des angeborenen Immunsystems Zellen, einschließlich Makrophagen ⁶ und Mikroglia ^7. Um miRNA-vermittelten Pfade, die Mikroglia-Phänotyp, biologische Funktion zu definieren, und Mikroglia von anderen Arten von Makrophagen zu unterscheiden zu untersuchen, ist es wichtig, quantitative Erfassung der Expression bestimmter microRNAs in verschiedenen Teilmengen von CNS-ansässigen Mikroglia. Gängige Methoden zur Messung der Expression von miRNAs im ZNS gehören quantitative PCR aus ganzen neuronalen Gewebe und in situ Hybridisierung. Allerdings ist die quantitative PCR aus ganzen Gewebehomogenat nicht zulassen, die Bewertung der Expression von miRNA in Mikroglia, die nur 5-15% der Zellen des neuronalen Gewebes darstellen. In-situ-Hybridisierung erlaubt die Beurteilung der Expression von microRNA in spezifischen Zelltypen in den Gewebeschnitten, aber diese Methode ist nicht ganz quantitativ. In diesem Bericht beschreiben wir eine quantitative und Sensitive Methode zum Nachweis von miRNA durch real-time PCR in Mikroglia von normalen ZNS oder während Neuroinflammation mit experimentellen autoimmunen Enzephalomyelitis (EAE), ein Mausmodell für MS isoliert. Das beschriebene Verfahren wird nützlich sein, um die Höhe der Expression von microRNAs in Mikroglia im normalen ZNS oder während Neuroinflammation mit verschiedenen Pathologien wie MS, Schlaganfall, traumatische Verletzungen, die Alzheimer-Krankheit und Hirntumoren zu messen.

Protocol

1. Isolierung der Mikroglia von normalen ZNS Isolierung von Mikroglia wird wie zuvor mit Modifikationen 3 beschrieben durchgeführt. Bereiten Sie Instrumente zur Präparation und Perfusion: Scheren, Pinzetten, 10 ml Spritze mit Nadel 27g, 15 ml Dounce Homogenisator (Teflon / Glas), 40 mu m Nylon Zellsieb, 40% und 70% Percoll-Lösungen, 1X PBS. Einschläfern Mäusen durch schnelles Ersticken (Entzug von Sauerstoff) in CO 2-Kamera und sofort übertrag…

Discussion

Kürzlich wurde großes Interesse an Mikroglia und Beteiligung dieser Zellen bei vielen Erkrankungen, die mit Neuroinflammation und Neurodegeneration verbunden gegeben. Darüber hinaus wurde die Rolle von microRNAs bei der Differenzierung von Immun-und Krebszellen sich in den letzten Jahren gewachsen ^5,10. Wir haben zuvor die Rolle der miR-124 in der Wartung von nicht-aktivierten oder ruhenden Phänotyp der Mikroglia im normalen ^ZNS-7 berichtet, aber die Rolle der anderen Arten von Mikro-RNAs in Mi…

Materials

Name of the reagent	Company	Catalogue number	Comments
1X PBS	GIBCO	14190	Can be prepared from dry components in the laboratory, pH: 7.2-7.4
10X PBS	Thermo Scientific	SH30258.02	Can be prepared from dry components in the laboratory, pH: 7.2-7.4
DMEM; FBS	GBCO	11965; 10438
miRVana kit	Invitrogen	AM1561
Percoll	Sigma	P4937-500 ml	100 ml of 100% Percoll is prepared by mixing 10 ml of 10X PBS and 90 ml of Percoll from Sigma. 50 ml of 70% Percoll is prepared by mixing of 35 ml of 100% Percoll and 15 ml of DMEM 50 ml of 40% Percoll is prepared by mixing 20 ml of 100% Percoll and 30 ml of 1X PBS
MOG35-55 peptide	AnaSpec Inc	60130-5
CFA	DIFCO	263810
Pertussis Toxin	Sigma	P7208
FcR blocking antibodies	BD Biosciences	553142	Clone 2.4G2
Anti-CD11b–PE mAb	BD Biosciences	553311	Can be used with different fluorophores (e.g. AF488)
Anti-CD45-APC-Cy7 mABs	Biolegend	103116	Can be used with different fluorophores (e.g. APC)
Paraformaldehyde (16%)	EMS Inc	15710	Dilute 1:15 in 1X PBS
15% TBE-Urea Gel	Life Technologies Inc.	EC68855BOX
TaqMan MicroRNA Reverse Transcription Kit	Life Technologies Inc	4366596
TaqMan Universal PCR Master Mix	Life Technologies Inc	4304437
TaqMan MicroRNA Assays mmu-miR-124a	Life Technologies Inc	4427975 ID 001182
TaqMan MicroRNA Assays snoRNA-55	Life Technologies Inc	4427975 ID 001228
Nuclease-free water	Life Technologies Inc	AM9937	Nuclease-free water
384-well clear optical reaction plate	Life Technologies Inc.	4309849	Can be substituted with other plates (e.g. 96 well plate) in different real-time PCR instruments
Dounce homogenizer (15 ml)	Wheaton Science Products.	358044	Teflon/glass
40 μ nylon cell strainer	Falcon	352340
Big centrifuge	Sorval	RT 6000B	Rotor diameter 18.5 cm
Small centrifuge	Eppendorf	5415 R	Rotor diameter 6.5 cm
Real-time PCR Instrument	Life Technologies Inc.	AB 7900 HT	Can be substituted with other instruments
Flow cytometer	BD Biosciencess	LSR II	Can be substituted with other instruments
FACS	BD Biosciences	FACSAria	Can be substituted with other instruments
Nanodrop spectrophotometer	Thermo Scientific	Nanodrop 1000