Detektering av MikroRNA i Mikroglia av Real-time PCR i normala CNS och under Neuroinflammation

Summary

Mikroglia är bosatta makrofager som ger den första försvarslinjen och immun övervakning av det centrala nervsystemet. MikroRNA är regulatoriska molekyler som spelar en viktig roll i många fysiologiska processer, inklusive aktivering och differentiering av makrofager. I den här artikeln beskriver vi den metod för mätning av mikroRNA i mikroglia.

Abstract

Mikroglia är celler av myeloid härkomst som finns under det centrala nervsystemet (CNS) ^1. Dessa celler spelar en viktig roll i patologier av många sjukdomar är associerade med neuroinflammation såsom multipel skleros (MS) ^2. Mikroglia i en normal CNS uttrycka makrofag markör CD11b och uppvisar en vilande fenotyp genom att uttrycka låga nivåer av aktivering markörer som CD45. Under patologiska händelser i CNS, mikroglia bli aktiverade bestämd genom uppreglering av CD45 och andra markörer ^3. De faktorer som påverkar mikroglia fenotyp och funktioner i CNS är inte väl studerat. MikroRNA (miRNA) är en växande familj av konserverade molekyler (~ 22 nukleotider långa) som är involverade i många normala fysiologiska processer såsom celltillväxt och differentiering ⁴ och sjukdomar såsom inflammation ^5. MiRNA nedreglera uttrycket av vissa målgener genom att binda komplementära sekvenser avir mRNA och spela en viktig roll i aktiveringen av medfödda immunceller, inklusive makrofager ⁶ och mikroglia ^7. För att undersöka miRNA-medierade reaktionsvägar som definierar microglial fenotypen, biologisk funktion, och för att skilja mikroglia från andra typer av makrofager, är det viktigt att kvantitativt bedöma expression av särskilda mikroRNA i distinkta undergrupper av CNS-inhemska mikroglia. Vanliga metoder för att mäta uttrycket av miRNA i CNS innefattar kvantitativ PCR från hela neuronal vävnad och hybridisering in situ. Emellertid tillåter inte kvantitativ PCR från hela vävnadshomogenat inte bedömningen av uttrycket av miRNA i mikroglia, som representerar endast 5-15% av de celler av neuronal vävnad. Hybridisering in situ möjligt att bedöma om uttrycket av mikroRNA i specifika celltyper i de vävnadssnitt, men denna metod är inte helt kvantitativ. I denna rapport beskriver vi en kvantitativ och senstiv metod för detektion av miRNA genom realtids-PCR i mikroglia isolerades från normala CNS eller vid neuroinflammation användning experimentell autoimmun encefalomyelit (EAE), en mus-modell för MS. Den beskrivna metoden är användbar för att mäta nivån av uttryckning av mikroRNA i mikroglia i normala CNS eller vid neuroinflammation associerad med olika sjukdomstillstånd inklusive MS, stroke, traumatisk skada, Alzheimers sjukdom och hjärntumörer.

Protocol

1. Isolering av mikroglia från normal CNS Isolering av mikroglia utförs såsom har beskrivits tidigare med modifieringar 3. Förbered instrument för dissekering och perfusion: saxar, pincetter, 10 ml spruta med 27g nål, 15 ml Dounce homogeniseringsanordning (Teflon / glas), 40 m nylon cellfilter, 40% och 70% Percoll lösningar 1X PBS. Euthanize möss med snabb kvävning (berövande av syre) i CO 2 kamera och omedelbart överföra dem till labora…

Discussion

Nyligen stort intresse gavs till mikroglia och engagemang av dessa celler i många patologier i samband med neuroinflammation och neurodegeneration. Dessutom har betydelsen av mikroRNA i differentieringen av immun-och cancerceller ökat dramatiskt under de senaste åren ^5,10. Vi har tidigare rapporterat rollen av MIR-124 för att upprätthålla icke-aktiverade eller vilande fenotyp av mikroglia i normala CNS ^7, men rollen av de andra typerna av mikroRNA i mikroglia fenotyp och aktiveringstillstånd…

Materials

Name of the reagent	Company	Catalogue number	Comments
1X PBS	GIBCO	14190	Can be prepared from dry components in the laboratory, pH: 7.2-7.4
10X PBS	Thermo Scientific	SH30258.02	Can be prepared from dry components in the laboratory, pH: 7.2-7.4
DMEM; FBS	GBCO	11965; 10438
miRVana kit	Invitrogen	AM1561
Percoll	Sigma	P4937-500 ml	100 ml of 100% Percoll is prepared by mixing 10 ml of 10X PBS and 90 ml of Percoll from Sigma. 50 ml of 70% Percoll is prepared by mixing of 35 ml of 100% Percoll and 15 ml of DMEM 50 ml of 40% Percoll is prepared by mixing 20 ml of 100% Percoll and 30 ml of 1X PBS
MOG35-55 peptide	AnaSpec Inc	60130-5
CFA	DIFCO	263810
Pertussis Toxin	Sigma	P7208
FcR blocking antibodies	BD Biosciences	553142	Clone 2.4G2
Anti-CD11b–PE mAb	BD Biosciences	553311	Can be used with different fluorophores (e.g. AF488)
Anti-CD45-APC-Cy7 mABs	Biolegend	103116	Can be used with different fluorophores (e.g. APC)
Paraformaldehyde (16%)	EMS Inc	15710	Dilute 1:15 in 1X PBS
15% TBE-Urea Gel	Life Technologies Inc.	EC68855BOX
TaqMan MicroRNA Reverse Transcription Kit	Life Technologies Inc	4366596
TaqMan Universal PCR Master Mix	Life Technologies Inc	4304437
TaqMan MicroRNA Assays mmu-miR-124a	Life Technologies Inc	4427975 ID 001182
TaqMan MicroRNA Assays snoRNA-55	Life Technologies Inc	4427975 ID 001228
Nuclease-free water	Life Technologies Inc	AM9937	Nuclease-free water
384-well clear optical reaction plate	Life Technologies Inc.	4309849	Can be substituted with other plates (e.g. 96 well plate) in different real-time PCR instruments
Dounce homogenizer (15 ml)	Wheaton Science Products.	358044	Teflon/glass
40 μ nylon cell strainer	Falcon	352340
Big centrifuge	Sorval	RT 6000B	Rotor diameter 18.5 cm
Small centrifuge	Eppendorf	5415 R	Rotor diameter 6.5 cm
Real-time PCR Instrument	Life Technologies Inc.	AB 7900 HT	Can be substituted with other instruments
Flow cytometer	BD Biosciencess	LSR II	Can be substituted with other instruments
FACS	BD Biosciences	FACSAria	Can be substituted with other instruments
Nanodrop spectrophotometer	Thermo Scientific	Nanodrop 1000