Udtømning og Rekonstituering af makrofager i mus
Summary
Makrofager spiller en central rolle i homeostase og patologi i mange væv. Protokollen præsenteres her beskriver metoder til nedbrydende makrofager<em> In vivo</em> Afledt polariserede makrofager fra knoglemarvsaspirater, og adoptivt overfører makrofager i mus. Disse teknikker tillader bestemmelse af den rolle, polariserede makrofager spiller i sundhed og sygdom.
Abstract
Makrofager er kritiske aktører i den medfødte immunrespons til infektiøs udfordring eller skade, indlede det medfødte immunforsvar og lede den erhvervede immunreaktion. Makrofag dysfunktion kan føre til en manglende evne til at montere en passende immunrespons, og som sådan er blevet impliceret i mange sygdomsforløb, herunder inflammatoriske tarmsygdomme. Makrofager vise polariserede fænotyper, der er groft inddeles i to kategorier. Klassisk aktiverede makrofager, aktiverede ved stimulering med IFNy eller LPS, spiller en vigtig rolle som reaktion på bakteriel provokation henviser alternativt aktiverede makrofager, aktiveret med IL-4 eller IL-13 deltager i debris skylning og vævsremodellering og har været impliceret i opløsning fase inflammation. Under en inflammatorisk reaktion in vivo, er makrofager ligger midt en kompleks blanding af infiltrerende immunceller og kan deltage i forværre eller resolving inflammation. For at definere den rolle, makrofager in situ i et helt dyr model, er det nødvendigt at undersøge effekten af ozonlagsnedbrydende makrofager fra komplekst miljø. At stille spørgsmål om den rolle, makrofag fænotype in situ, kan fænotypisk definerede polariserede makrofager udledes ex vivo, fra knoglemarvsaspirater og sat tilbage til mus, med eller uden forudgående udtynding af makrofager. I protokollen præsenteret her clodronat-holdige liposomer, versus PBS injicerede kontroller blev anvendt til at udtømme colon makrofager under dextrannatriumsulfat (DSS)-induceret colitis hos mus. Desuden blev polariserede makrofager afledt ex vivo og overført til mus ved intravenøs injektion. En advarsel til denne fremgangsmåde er, at clodronat-holdige liposomer udtømme alle professionelle fagocytter, herunder både dendritiske celler og makrofager, så for at sikre den effekt observeret ved nedbrydningen er makrofag-specifik, rekonstitution of fænotype ved adoptiv overførsel af makrofager er nødvendig. Systemisk makrofag udtømning hos mus kan også opnås ved tilbagekrydsning mus på en CD11b-DTR baggrund, som er en fremragende komplementær tilgang. Den fordel, clodronat-holdig liposomdispersions-medieret nedbrydning er, at det ikke kræver tid og de omkostninger der er involveret i tilbagekrydsning mus, og det kan anvendes i mus, uanset om baggrunden for mus (C57BL / 6, BALB / c eller blandet baggrund ).
Protocol
Discussion
Makrofager er fagocytiske celler, som spiller en vigtig rolle i immunsystemet. De er ansvarlige for at indlede den medfødte immunreaktion og lede den erhvervede immunreaktion. Typisk er klassisk aktiverede makrofager aktiveret ved IFNy eller LPS og er ansvarlige for fjernelse patogener og montering et inflammatorisk respons 1. Omvendt er alternativt aktiverede makrofager aktiveret med IL-4 eller IL-13 og spiller en rolle i debris skylning og vævsremodellering under opløsning af inflammation 1. S…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbejde blev understøttet af en "Grant i støtte for forskning" fra Crohns og Colitis Foundation of Canada til LMS, der understøttes af en canadisk Association of Gastroenterology / Canadian Association of Health Research / Crohns og Colitis Foundation of Canada New Investigator Award.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number |
| Clodronate-containing liposomes | Clodronateliposomes.org | |
| PBS-containing liposomes | Clodronateliposomes.org | |
| Sterile PBS pH7.4 | Invitrogen | 14190 |
| IMDM | Invitrogen | 12440 |
| Fetal Calf Serum (FCS) | Invitrogen | 12483 |
| acetic acid | BDH Aristar | BDH3092-500MLP |
| Monothioglycerol (MTG) | Sigma | 96-275 |
| Recombinant murine MCSF | Stemcell Technologies | 02951 |
| Recombinant murine GM-CSF | Stemcell Technologies | 02935 |
| Recombinant murine IL-3 | Stemcell Technologies | 02903 |
| Recombinant murine IFNγ | Stemcell Technologies | 02746 |
| Recombinant murine IL-4 | Stemcell Technologies | 02714 |
| Cell Dissociation Buffer | Invitrogen | 13150-016 |
| Rat anti-F4/80 Antibody | AbD Serotec | MCA497GA |
| Mouse anti-ArgI Antibody | BD Transduction Laboratories | 610708 |
Table 1. Specific reagents used in this protocol.
References
- Gordon, S. Alternative activation of macrophages. Nat. Rev. Immunol. 3, 23-35 (2003).
- Rescigno, M., Lopatin, U., Chieppa, M. Interactions among dendritic cells, macrophages, and epithelial cells in the gut: implications for immune tolerance. Curr. Opin. Immunol. 20, 669-675 (2008).
- Heinsbroek, S. E., Gordon, S. The role of macrophages in inflammatory bowel diseases. Expert Rev. Mol. Med. 11, e14 (2009).
- Collins, S. M., Piche, T., Rampal, P. The putative role of inflammation in the irritable bowel syndrome. Gut. 49, 743-745 (2001).
- Maeda, S. Colon cancer-derived factors activate NF-kappaB in myeloid cells via TLR2 to link inflammation and tumorigenesis. Mol. Med. Report. 4, 1083-1088 (2011).
- van Rooijen, N., van Kesteren-Hendrikx, E. Clodronate liposomes: perspectives in research and therapeutics. J. Liposome Res. 12, 81-94 (2002).
- Hunter, M. M. In vitro-derived alternatively activated macrophages reduce colonic inflammation in mice. Gastroenterology. 138, 1395-1405 (2010).
- Weisser, S. B. SHIP-deficient, alternatively activated macrophages protect mice during DSS-induced colitis. J. Leukoc. Biol. 90, 483-492 (2011).
- Qualls, J. E., Kaplan, A. M., van Rooijen, N., Cohen, D. A. Suppression of experimental colitis by intestinal mononuclear phagocytes. J. Leukoc. Biol. 80, 802-815 (2006).
- Van Rooijen, N., Sanders, A. Liposome mediated depletion of macrophages: mechanism of action, preparation of liposomes and applications. J. Immunol. Methods. 174, 83-93 (1994).
- Smith, P. Infection with a helminth parasite prevents experimental colitis via a macrophage-mediated mechanism. J. Immunol. 178, 4557-4566 (2007).
- van Rooijen, N., Hendrikx, E. Liposomes for specific depletion of macrophages from organs and tissues. Methods Mol. Biol. 605, 189-203 (2010).
- Kataoka, K. The roles of vitreal macrophages and circulating leukocytes in retinal neovascularization. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 52, 1431-1438 (2011).
- Weisser, S. B. Alternative activation of macrophages by IL-4 requires SHIP degradation. Eur. J. Immunol. 41, 1742-1753 (2011).
- Cailhier, J. F. Conditional macrophage ablation demonstrates that resident macrophages initiate acute peritoneal inflammation. J. Immunol. 174, 2336-2342 (2005).
