الحمض النووي الريبي التدخل ناقلات القائم على دراسة وظيفة الجينات في سرطان
Summary
تدخل الجيش الملكي النيبالي (رني) تمتلك مزايا عديدة أكثر من خروج المغلوب الجينات، واستخدمت على نطاق واسع باعتبارها أداة في دراسات الجينات الوظيفية. جعلت من اختراع تكنولوجيا الحمض النووي رني ناقلات القائم على المدى الطويل، ومحرض ضربة قاضية الجين ممكن، وزادت أيضا في جدوى إسكات الجينات<em> في الجسم الحي</em>.
Abstract
تدخل الجيش الملكي النيبالي (رني) يحول دون التعبير الجيني من قبل mRNAs الهدف المهينة على وجه التحديد. منذ اكتشاف المزدوج تقطعت بهم السبل الحمض النووي الريبي التدخل الصغيرة (سيرنا) في إسكات الجينات 1، وأصبح رني أداة بحث قوية في الدراسات وظيفة الجين. بالمقارنة مع حذف الجينية، [رني بوساطة إسكات الجينات تمتلك العديد من المزايا، مثل السهولة التي تتم فيها ومدى ملاءمتها لمعظم خطوط الخلية. وقد أظهرت دراسات متعددة في تطبيقات تكنولوجيا رني في أبحاث السرطان. على وجه الخصوص، جعلت تطوير تكنولوجيا مكافحة ناقلات القائم على الحمض النووي الريبي لانتاج صغير دبوس الشعر (shRNA) مدفوعا U6 أو مروج H1 على المدى الطويل والجينات محرض إسكات 2،3 ممكن. استخدامه في تركيبة مع النواقل الفيروسية وراثيا، مثل الفيروسة البطيئة، تسهل الكفاءة العالية للتسليم shRNA و / أو الاندماج في الحمض النووي الجيني للتعبير shRNA مستقر.
نحن تصف detaileد الإجراء باستخدام تكنولوجيا الحمض النووي رني ناقلات القائم على تحديد وظيفة الجينات، بما في ذلك بناء ناقلات lentiviral معربا عن shRNA، وإنتاج الفيروسة البطيئة وإصابة الخلية، والدراسات الفنية باستخدام نموذج الفأر طعم أجنبي.
تم الإبلاغ عن الاستراتيجيات المختلفة في توليد بنيات shRNA. وصف بروتوكول هنا توظيف تضخيم PCR وربط 3-شظية يمكن استخدامها لمباشرة وكفاءة توليد shRNA التي تحتوي على ثوابت lentiviral دون أن تترك أي المتاخمة اضافية النوكليوتيدات لتسلسل shRNA الترميز. حيث يمكن خفض الكاسيت shRNA التعبير عن هذه الاستراتيجية التي أنشأتها من قبل إنزيمات التقييد، ويمكن بسهولة انتقلوا إلى ناقلات أخرى مع مختلف علامات الفلورسنت أو المضادات الحيوية. ويمكن استخدام الكواشف ترنسفكأيشن معظم الإنتاج التجاري في الفيروسة البطيئة. ومع ذلك، في هذا التقرير، ونحن نقدم وسيلة اقتصادية باستخدام الكالسيوم فوسفات هطول الأمطار التي يمكن أن تحقق أكثر من 90٪ في كفاءة ترنسفكأيشن293T الخلايا. مقارنة التأسيسي ناقلات التعبير shRNA، نظام shRNA محرض هو مناسبة خاصة لاسقاط الجين ضروري لتكاثر الخلايا. علينا أن نبرهن على إسكات الجينات من يانغ يين 1 (YY1)، وهو الجين الورمي المحتملة في الاصابة بسرطان الثدي 4،5، من تيت، وعلى نظام shRNA محرض وآثارها على تكوين ورم. بحث باستخدام الفيروسة البطيئة يتطلب مراجعة والموافقة على بروتوكول السلامة الاحيائية من قبل لجنة السلامة من مؤسسة الباحث. بحث باستخدام نماذج حيوانية يتطلب مراجعة والموافقة على بروتوكول الحيوان من قبل لجنة رعاية الحيوان واستخدام (ACUC) من مؤسسة الباحث.
Protocol
Discussion
هذا البروتوكول وصفا لطريقة لاسقاط الجين باستخدام shRNA ووضع تصور لتأثيره البيولوجية باستخدام التصوير bioluminescent من نمو الخلايا السرطانية في الجسم الحي. الموقع هدفا لshRNA يجب أن لا تحتوي على أي من مواقع تقييد الثلاثة (BamHI، HindIII وEcoRI) المستخدمة لsubcloning. في سيناريو نادر عند…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وأيد هذا العمل في جزء من المنح باحث (116403-RSG-09-082-01-MGO) من الجمعية الأميركية للسرطان وصناديق جماعية من ويك فورست العلوم الصحية جامعة إلى ع. وأيد DBS بواسطة منحة لجنة التحقيق الوطنية 5T32CA079448 التدريب.
Materials
In addition to common laboratory equipment used for RNA and protein analyses and cell culture, the following materials and reagents are required for this protocol.
| Name of the reagent |
| Biosafety Cabinet suitable for Biosafety Level 2 containment |
| PCR thermocycler |
| Ultracentrifuge |
| Anesthesia-induction chamber with isoflurane scavengers |
| Digital Vernier caliper |
| IVIS imaging system |
| Highly competent DH5a E. coli |
| EcoRI, BamHI, & HindIII restriction enzymes |
| T4 DNA Ligase |
| Third generation lentivirus packaging plasmids VSV-G, pRSV-Rev and pMDLg/pRRE |
Materials List
References
- Elbashir, S. M. Duplexes of 21-nucleotide RNAs mediate RNA interference in cultured mammalian cells. Nature. 411, 494-498 (2001).
- Sui, G. A DNA vector-based RNAi technology to suppress gene expression in mammalian cells. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99, 5515-5520 (2002).
- Brummelkamp, T. R., Bernards, R., Agami, R. A system for stable expression of short interfering RNAs in mammalian cells. Science. 296, 550-553 (2002).
- Zhang, Q., Stovall, D. B., Inoue, K., Sui, G. The oncogenic role of Yin Yang 1. Crit. Rev. Oncog. 16, 163-197 (2011).
- Wan, M. Yin Yang 1 plays an essential role in breast cancer and negatively regulates p27. Am. J. Pathol. , (2012).
- Sui, G., Shi, Y. Gene silencing by a DNA vector-based RNAi technology. Methods in Molecular Biology. 309, 205-218 (2005).
- Trower, M. K. A rapid PCR-based colony screening protocol for cloned inserts. Methods Mol. Biol. 58, 329-333 (1996).
- Lizee, G. Real-time quantitative reverse transcriptase-polymerase chain reaction as a method for determining lentiviral vector titers and measuring transgene expression. Hum. Gene Ther. 14, 497-507 (2003).
- Zhang, B. The significance of controlled conditions in lentiviral vector titration and in the use of multiplicity of infection (MOI) for predicting gene transfer events. Genet Vaccines Ther. 2, 6 (2004).
- Geran, R. I., Greenberg, N. H., MacDonald, M. M., Schumacher, A. M., Abbott, B. J. Protocols for screening chemical agents and natural products against animal tumors and other biological systems. Cancer Chemother. Rep. 3, 1-103 (1972).
- Massoud, T. F., Gambhir, S. S. Molecular imaging in living subjects: seeing fundamental biological processes in a new light. Genes Dev. 17, 545-580 (2003).
- Inoue, H., Nojima, H., Okayama, H. High efficiency transformation of Escherichia coli with plasmids. Gene. 96, 23-28 (1990).
- Toledo, J. R., Prieto, Y., Oramas, N., Sanchez, O. Polyethylenimine-based transfection method as a simple and effective way to produce recombinant lentiviral vectors. Appl. Biochem. Biotechnol. 157, 538-544 (2009).
- Rubinson, D. A. A lentivirus-based system to functionally silence genes in primary mammalian cells, stem cells and transgenic mice by RNA interference. Nat Genet. 33, 401-406 (2003).
- Sui, G. Yin Yang 1 is a negative regulator of p53. Cell. 117, 859-872 (2004).
