Nanotopology van Celadhesie op variabele-Angle Total Internal Reflection fluorescentie microscopie (VA-TIRFM)

Summary

Topologie van celhechting op een substraat wordt gemeten met nanometer precisie door variabele hoek totale interne reflectie fluorescentiemicroscopie (VA-TIRFM).

Abstract

Oppervlakte topologie, bijv. cellen die groeien op een substraat, wordt bepaald met nanometer precisie door Variable Angle-Total Internal Reflection fluorescentiemicroscopie (VA-TIRFM). Cellen worden gekweekt op objectglaasjes transparante en geïncubeerd met een fluorescente merker homogeen verdeeld in de plasmamembraan. Verlichting vindt plaats door een parallelle laserbundel onder variabele hoek van totale interne reflectie (TIR) ​​met verschillende penetratiediepten van het evanescente elektromagnetische veld. Opnemen van fluorescentiebeelden bij bestraling ongeveer 10 verschillende hoeken toestaat cel-substraat afstanden te berekenen met een nauwkeurigheid van enkele nanometers. Verschillen van hechting tussen verschillende cellijnen, bijv. kankercellen en minder kwaadaardige cellen zijn dus bepaald. Bovendien kunnen mogelijke veranderingen van celadhesie op chemische of fotodynamische behandeling onderzocht. In vergelijking met andere methoden van super-resolutie microscopie belichting wordt gehoudenzeer klein, en geen beschadiging van levende cellen wordt verwacht.

Introduction

Wanneer een lichtbundel voortplant door een medium _{brekingsindex} n1 een interface aan een tweede medium _{brekingsindex} n2 <n _1, totale interne reflectie optreedt bij alle invalshoeken Θ, die groter zijn dan de kritische hoek Θ _c = arcsin (n ₂ / n _1). Ondanks dat volledig gereflecteerd de invallende lichtbundel roept een verdwijnende elektromagnetisch veld dat in het tweede medium en vervalt exponentieel met loodrechte afstand z van het grensvlak dringt volgens I (z) = I _{0 ^{ez / d (Θ).}} I (z) overeenkomt met de intensiteit van het elektromagnetische veld en d (Θ) de penetratiediepte bij golflengte λ, zoals gegeven door

d (Θ) = (λ/4π) ₍₁ ² n sin ² Θ – _{² 2} n) ^{-1 / 2}

Zoals gemeld in de literatuur ^1,2, I ₀ </sub> overeenkomt met de intensiteit van invallend licht I _e vermenigvuldigd met de transmissiefactor T (Θ) en de verhouding n ₂ / n _1. Indien het elektrisch veld vector van deze lichtbundel gepolariseerd loodrecht op het vlak van inval (de vlak opgespannen door de invallende en de gereflecteerde bundel) bevindt het transmissiecoëfficiënt van de

T (Θ) = 4 cos ² Θ / [1 – (n ₂ / nL ₁₎ ^2]

Voor de gedetecteerde fluorescentie-intensiteit in TIRFM metingen lichtabsorptie te worden geïntegreerd over alle lagen van het monster en vermenigvuldigd met de fluorescentie quantum opbrengst η van de desbetreffende kleurstof als de ruimtehoek van detectie Ω. Zoals eerder ^3, kan deze intensiteit worden beschreven

Ik _F (Θ) = AT (Θ) OC (z) ^{e-z / d (Θ)} dz

als alle factoren die onafhankelijk zijn f rom de invalshoek Θ en z de coördinaat vallen binnen de experimentele constant A. Vergelijking 3 kan analytisch opgelost als de concentratie c (z) van fluoroforen wordt beschouwd als bijna constant

– Op alle coördinaten z ≥ Δ, bijvoorbeeld in het cytoplasma van cellen met een afstand Δ van de interface. In dit geval integraal moet worden berekend z = Δ z = ∞ tot gevolg

Ik _F = A c T (Θ) d (Θ) ^{e-Δ / d (Θ)}

– Tussen z = Δ – t / 2 en z = Δ + T / 2, dat wil zeggen in een dunne laag van dikte t, bijvoorbeeld een celmembraan op een afstand Δ van de interface. In dit geval kan de fluorescentie intensiteit berekend als

Ik _F = A c T (Θ) ^{te-Δ / d (Θ),}

Als t klein in vergelijking met Δ.

ent "> Uit de vergelijkingen (4) en (5) cel-substraat afstanden Δ kan worden berekend als de beelden van fluorescentie intensiteit I _F opgenomen voor variabele hoeken Θ en als ln (I _F / T d) (Vgl. 4) of ln (I _F / T) (Vgl. 5) wordt bepaald als functie van 1 / d voor deze hoeken. Voor de membraan marker laurdan die in dit document (s. hieronder) evaluatie werd uitgevoerd volgens Vgl. 5.

Zoals eerder gerapporteerd ^3, beeldacquisitie en evaluatie vereist
– Een homogene verdeling van excitatie licht op het monster,
– Geldigheid van een 2-laags model (de brekingsindices n ₁ en n ₂ voor het substraat en het cytoplasma, respectievelijk). Dit geldt als de plasmamembraan is zeer dun, en indien de laag van het extracellulaire medium (tussen de cel en het substraat) klein is vergeleken met de golflengte van invallend licht.

Bovendien een matige numerieke apertuur(Meestal A ≤ 0,90) van de microscoop objectieflens voordeel zijn wanneer afwijkingen van helderheid door anisotropie van straling in het nabije veld van de diëlektrische interface.

Protocol

1. Zaaien en incubatie van cellen Seed individuele cellen, bijvoorbeeld U373-MG of U-251 MG-glioblastoma cellen bij een typische dichtheid van 100 cellen / mm 2 op een glasplaatje en ze 4872 uur in kweekmedium groeien (bijv. RPMI 1640 aangevuld met 10% foetaal kalfsserum en antibiotica) met een incubator bij 37 ° C en 5% CO2. Incuberen met een membraan marker, bijv. 6-dodecanoyl-2-dimethylamino naftaleen (laurdan) toegepast gedurende 60 min in een co…

Discussion

Een methode wordt beschreven voor het meten van cel-substraat afstanden nanometer precisie. Op dit moment, de wijze van super-resolutie microscopie, bijvoorbeeld op basis van gestructureerde verlichting ⁷ of op single molecule detectie ^{8 tot 10} en stimulated emission depletion (STED) microscopie ¹¹ zijn van groot belang. Geen van deze technieken maakt echter een axiale resolutie van minder dan 50 nm. Bovendien vrij hoge bestraling van 50100 W / cm ² nodig voor enkel m…

Materials

Name	Company	Type	Comments
Incubator	Nunc	Nunc Cellstar QM1300SVBA
Laminar flow	Holten Safe	S2010 1.2 EN GG 1LN
DMEM + 10%FCS + 1 % Penicillin / Streptomycin	BIOCHROM		Cultivation medium
Glass object slides	Marienfeld	Pure white glass	Special cleaning procedure used
6-dodecanoyl-2-dimethylamino naphthalene (laurdan)	Molecular Probes		Fluorescent marker (Stock solution: 2 mM in ethanol)
Microscope	Carl Zeiss	Axioplan 1
Laser diode	PicoQuant	LDH 400 with driver PDL 800-B	Wavelength: 391 nm
Single mode fiber system	Point Source	kineFlex	Used with collimating optics
EMCCD camera	Andor	DV887DC	Back illuminated camera