Nanotopology de adesão celular em cima de ângulo variável Microscopia de Fluorescência reflexão interna total (VA-TIRFM)

Summary

Topologia de adesão celular num substrato é medida com uma precisão nanométrica de ângulo variável por microscopia de fluorescência de reflexão interna total (TIRFM-VA).

Abstract

Topologia de superfície, por exemplo, que as células crescem sobre um substrato, é determinada com uma precisão nanométrica por Variable Angle-Fluorescence Microscopy Internal Reflection total (TIRFM-VA). As células são cultivadas em lâminas transparentes e incubaram-se com um marcador fluorescente homogeneamente distribuídos na sua membrana plasmática. Iluminação ocorre por um feixe de laser paralelo sob um ângulo variável de reflexão interna total (TIR), com diferentes profundidades de penetração do campo electromagnético evanescente. A gravação de imagens de fluorescência após irradiação a cerca de 10 diferentes ângulos permite calcular distâncias célula-substrato, com uma precisão de alguns nanómetros. As diferenças de adesão entre as linhas de células diferentes, por exemplo, células cancerosas e células malignas, menos são assim determinados. Além disso, as variações possíveis de adesão das células mediante tratamento químico ou fotodinâmica pode ser examinado. Em comparação com outros métodos de super-resolução de exposição de microscopia de luz é mantidadanos muito pequena, e não de células vivas é de esperar a ocorrência.

Introduction

Quando um feixe de luz que se propaga através de um meio de índice de refracção n ₁ encontra uma interface para um segundo meio de índice de refracção n ₂ <n _1, a reflexão interna total ocorre em todos os ângulos de incidência Θ, que são maiores do que o ângulo crítico Θ _c = arcsin (n ₂ / n _1). Apesar de ter sido totalmente reflectido do feixe de luz incidente evoca um campo electromagnético evanescente que penetra no segundo meio e decai exponencialmente com a distância perpendicular a partir da interface de z de acordo com a I (z) = I _{0 ^{ez / d (Θ).}} I (z) corresponde à intensidade do campo electromagnético e d (Θ) para a profundidade de penetração no comprimento de onda λ, como dada pela

d (Θ) = (λ/4π) (n ₁ ^{2 2} Θ pecado – n _{² 2)} ^{-1 / 2}

Conforme relatado na literatura ^1,2, I ₀ </sub> corresponde à intensidade da luz incidente I _e multiplicada com o factor de transmissão T (Θ) e a relação de n ₂ / n _1. Se o vector do campo eléctrico do feixe de luz é perpendicular ao plano de polarização da incidência (isto é, o plano gerado pelo incidente e do feixe reflectido), este factor de transmissão é dada pela

T (Θ) = 4 cos ² Θ / [1 – (n ₂ / nL ₁₎ ^2]

Para a intensidade de fluorescência detectada no TIRFM medições, a absorção de luz tem de ser integrado ao longo de todas as camadas da amostra e multiplicado com o rendimento quântico de fluorescência do corante η relevantes, bem como com o ângulo sólido de detecção Ω. Como relatado anteriormente ^3, esta intensidade pode ser descrita pela

Eu _F (Θ) = AT (Θ) OC (z) ^{e-z / d (Θ)} dz

se todos os fatores que são f independente rom o ângulo de incidência e do Θ z coordenadas estão incluídos dentro da Equação A. experimental constante 3 pode ser resolvido analiticamente, se a concentração c (z) de fluoróforos é considerado para ser quase constante

– Quer no todo z ≥ Δ coordenadas, por exemplo, dentro do citoplasma das células com uma distância Δ partir da interface. Neste caso, a integral tem de ser calculada a partir de z = Δ para z = ∞ resultando

Eu _F = A c T (Θ) d (Θ) ^{e-Δ / d (Θ)}

– Ou entre z = Δ – t / 2 e z = Δ + t / 2, ou seja, dentro de uma fina camada de espessura t, por exemplo, uma membrana celular, localizado a uma distância a partir da interface Δ. Neste caso, a intensidade de fluorescência pode ser calculado como

Eu _F = A c T (Θ) ^{te-Δ / d (Θ),}

se t é pequeno em comparação com Δ.

> ent "A partir das Equações (4) e (5) da célula-substrato distâncias Δ pode ser calculado, se as imagens de intensidade de fluorescência, _F I são registados por ângulos variáveis ​​Θ, e se ln (I _F / T d) (Eq. 4) ou ln (I _F / T) (Eq. 5) é avaliada como uma função de 1 / d para esses ângulos. Para a membrana laurdan marcador utilizado no presente documento (s. abaixo), a avaliação foi realizada de acordo com a Equação 5..

Como relatado anteriormente ³ de aquisição de imagem, e requer a avaliação
– Distribuição homogênea da luz de excitação sobre a amostra,
– A validade de um modelo de 2-camadas (com os índices de refracção n ₁ e n ₂ para o substrato e do citoplasma, respectivamente). Isto aplica-se a membrana do plasma é muito fina e, se a camada do meio extracelular (entre a célula e o substrato) é pequeno em comparação com o comprimento de onda da luz incidente.

Além disso, a abertura de uma moderada numérica(Tipicamente 0,90 ≤ A) da lente da objectiva do microscópio é vantajosa para evitar desvios de brilho devido a anisotropia da radiação no domínio próximo da interface dielétrico.

Protocol

1. Sementeira e incubação de células Semente de células individuais, por exemplo, U373-MG ou células U-251 MG-glioblastoma a uma densidade típica de 100 células / mm 2 sobre uma lâmina de vidro e crescê-los para 4872 horas em meio de cultura (por exemplo, meio RPMI 1640 suplementado com 10% de soro fetal de vitela e antibióticos), utilizando uma incubadora a 37 ° C e 5% CO 2. Incubar as células com um marcador de membrana, por exemplo, 6-d…

Discussion

É descrito um método para a medição de célula-substrato distâncias com uma precisão nanométrica. Presentemente, os métodos de resolução super-microscopia, por exemplo, com base na iluminação estruturada ⁷ ou em ^8-10 de detecção de moléculas isoladas, assim como depleção emissão estimulada (STED) Microscopia ¹¹ são de considerável interesse. Nenhuma destas técnicas, contudo, permite uma resolução axial inferior a 50 nm. Além disso, a irradiância bastante…

Materials

Name	Company	Type	Comments
Incubator	Nunc	Nunc Cellstar QM1300SVBA
Laminar flow	Holten Safe	S2010 1.2 EN GG 1LN
DMEM + 10%FCS + 1 % Penicillin / Streptomycin	BIOCHROM		Cultivation medium
Glass object slides	Marienfeld	Pure white glass	Special cleaning procedure used
6-dodecanoyl-2-dimethylamino naphthalene (laurdan)	Molecular Probes		Fluorescent marker (Stock solution: 2 mM in ethanol)
Microscope	Carl Zeiss	Axioplan 1
Laser diode	PicoQuant	LDH 400 with driver PDL 800-B	Wavelength: 391 nm
Single mode fiber system	Point Source	kineFlex	Used with collimating optics
EMCCD camera	Andor	DV887DC	Back illuminated camera