Nanotopology de adesão celular em cima de ângulo variável Microscopia de Fluorescência reflexão interna total (VA-TIRFM)

Summary

Topologia de adesão celular num substrato é medida com uma precisão nanométrica de ângulo variável por microscopia de fluorescência de reflexão interna total (TIRFM-VA).

Abstract

Topologia de superfície, por exemplo, que as células crescem sobre um substrato, é determinada com uma precisão nanométrica por Variable Angle-Fluorescence Microscopy Internal Reflection total (TIRFM-VA). As células são cultivadas em lâminas transparentes e incubaram-se com um marcador fluorescente homogeneamente distribuídos na sua membrana plasmática. Iluminação ocorre por um feixe de laser paralelo sob um ângulo variável de reflexão interna total (TIR), com diferentes profundidades de penetração do campo electromagnético evanescente. A gravação de imagens de fluorescência após irradiação a cerca de 10 diferentes ângulos permite calcular distâncias célula-substrato, com uma precisão de alguns nanómetros. As diferenças de adesão entre as linhas de células diferentes, por exemplo, células cancerosas e células malignas, menos são assim determinados. Além disso, as variações possíveis de adesão das células mediante tratamento químico ou fotodinâmica pode ser examinado. Em comparação com outros métodos de super-resolução de exposição de microscopia de luz é mantidadanos muito pequena, e não de células vivas é de esperar a ocorrência.

Introduction

Quando um feixe de luz que se propaga através de um meio de índice de refracção n ₁ encontra uma interface para um segundo meio de índice de refracção n ₂ 1, a reflexão interna total ocorre em todos os ângulos de incidência Θ, que são maiores do que o ângulo crítico Θ _c = arcsin (n ₂ / n _1). Apesar de ter sido totalmente reflectido do feixe de luz incidente evoca um campo electromagnético evanescente que penetra no segundo meio e decai exponencialmente com a distância perpendicular a partir da interface de z de acordo com a I (z) = I _{0 ^{ez / d (Θ).}} I (z) corresponde à intensidad....

Protocol

1. Sementeira e incubação de células

1. Semente de células individuais, por exemplo, U373-MG ou células U-251 MG-glioblastoma a uma densidade típica de 100 células / mm ² sobre uma lâmina de vidro e crescê-los para 4872 horas em meio de cultura (por exemplo, meio RPMI 1640 suplementado com 10% de soro fetal de vitela e antibióticos), utilizando uma incubadora a 37 ° C e 5% CO _2.
2. Incubar as células com um marcador de membrana, por exemplo, 6-dodecanoil-2-dimetilamino-naftaleno (laurdan) aplicado durante 60 minutos a uma concentração de 8 mM (em meio de cultura) ^4, ou um marcador de citoplasm....

Discussion

É descrito um método para a medição de célula-substrato distâncias com uma precisão nanométrica. Presentemente, os métodos de resolução super-microscopia, por exemplo, com base na iluminação estruturada ⁷ ou em ^8-10 de detecção de moléculas isoladas, assim como depleção emissão estimulada (STED) Microscopia ¹¹ são de considerável interesse. Nenhuma destas técnicas, contudo, permite uma resolução axial inferior a 50 nm. Além disso, a irradiância bastante elevada de 50,100 W / cm .......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Nome	Companhia	Tipo	Comentários
Incubadora	Nunc	Nunc Cellstar QM1300SVBA
Fluxo laminar	Holten Seguro	S2010 1,2 PT GG 1LN
DMEM + 10% FCS + 1% de Penicilina / Estreptomicina	Biochrom		Meio de cultura
Objeto lâminas de vidro	Marienfeld	Vidro branco puro	Procedimento de limpeza especial usado
6-dodecanoil-2-dimetilamino-naftaleno (laurdan)	Molecular Probes		Marcador fluorescente (solução de armazém: 2 mM em etanol)
Microscópio	Carl Zeiss	Axioplan 1
Diodo laser	PicoQuant	LDH 400 com motorista PDL 800-B	Comprimento de onda: 391 nm
Sistema de fibra monomodo	Fonte ponto	kineFlex	Usado com óptica de colimação
Câmera EMCCD	Andor	DV887DC	Câmera traseira iluminada