Langerhans अलगाव के माउस आइलेट शुद्ध Collagenase और तटस्थ Protease का एक संयोजन का उपयोग
Summary
माउस आइलेट अलगाव का एक विस्तृत विवरण स्वस्थानी अग्नाशय ductal और शुद्ध कोलैजिनेज और तटस्थ protease का एक संयोजन के केन्युलेशन छिड़काव की तकनीक का उपयोग वर्णित है.
Abstract
The interrogation of beta cell gene expression and function in vitro has squarely shifted over the years from the study of rodent tumorigenic cell lines to the study of isolated rodent islets. Primary islets offer the distinct advantage that they more faithfully reflect the biology of intracellular signaling pathways and secretory responses. Whereas the method of islet isolation using tissue dissociating enzyme (TDE) preparations has been well established in many laboratories1-4, variations in the consistency of islet yield and quality from any given rodent strain limit the extent and feasibility of primary islet studies. These variations often occur as a result of the crude partially purified TDEs used in the islet isolation procedure; TDEs frequently exhibit lot-to-lot variations in activity and often require adjustments to the dose of enzyme used. A small number of reports have used purified TDEs for rodent cell isolations5, 6, but the practice is not widespread despite the routine use and advantages of purified TDEs for human islet isolations. In collaboration with VitaCyte, LLC (Indianapolis, IN), we developed a modified mouse islet isolation protocol based on that described by Gotoh7, 8, in which the TDEs are perfused directly into the pancreatic duct of mice, followed by crude tissue fractionation through a Histopaque gradient9, and isolation of purified islets. A significant difference in our protocol is the use of purified collagenase (CIzyme MA) and neutral protease (CIzyme BP) combination. The collagenase was characterized by the use of a6 fluorescence collagen degrading activity (CDA) assay that utilized fluorescently labeled soluble calf skin fibrils as substrate6. This substrate is more predictive of the kinetics of collagen degradation in the tissue matrix because it relies on native collagen as the substrate. The protease was characterized with a sensitive fluorescent kinetic assay10. Utilizing these improved assays along with more traditional biochemical analysis enable the TDE to be manufactured more consistently, leading to improved performance consistency between lots. The protocol described in here was optimized for maximal islet yield and optimal islet morphology using C57BL/6 mice. During the development of this protocol, several combinations of collagenase and neutral proteases were evaluated at different concentrations, and the final ratio of collagenase:neutral protease of 35:10 represents enzyme performance comparable to Sigma Type XI. Because significant variability in average islet yields from different strains of rats and mice have been reported, additional modifications of the TDE composition should be made to improve the yield and quality of islets recovered from different species and strains.
Protocol
Discussion
इस प्रोटोकॉल में, हम cannulation, कोलैजिनेज छिड़काव, और murine अग्न्याशय की हदबंदी के लिए हमारी प्रक्रिया में वर्णित है islets के Langerhans को अलग करने के लक्ष्य के साथ. तकनीकी तौर पर, हमारे विधि, एक बार में महारत हासिल है, अग्न्याशय अलगाव के लिए 4 पशु euthanizing के मिनट के भीतर की अनुमति है, करना चाहिए और 1 घंटे द्वारा एक एकल जानवर से islets के अलगाव में परिणाम चाहिए. तकनीक की तीव्रता हमें islets से एक विशिष्ट खंड में 12 चूहों को अलग करने के लिए अनुमति देता है, जिससे 3000 islets के अलगाव में जिसके परिणामस्वरूप.
अन्य प्रोटोकॉल कि कोलैजिनेज कच्चे तेल की तैयारी का उपयोग के विपरीत, हमारे प्रोटोकॉल शुद्ध proteases, सीआई zyme Collagenase एमए और सीआई zyme बी.पी. Protease का उपयोग. TDE तैयारियाँ कि व्यावसायिक रूप से उपलब्ध हैं की स्थिरता में बदलाव की आवश्यकता है कि प्रत्येक स्थल है और व्यक्तिगत रूप से परीक्षण किया जा अनुकूलित सामान्य उपयोग से पहले. यह बहुत कुछ करने के लिए बहुत परिवर्तनशीलता हमें पुरी के उपयोग पर विचार करने के लिए नेतृत्वVitaCyte से fied TDES. ये बेहद शुद्ध TDES संवेदनशील प्रतिदीप्ति लेबल सब्सट्रेट assays के उपयोग सहित कई तरीकों से होती हैं. प्रतिदीप्ति सीडीए परख Collagenase के विभिन्न रूपों है कि आणविक अपमानजनक देशी कोलेजन में अलग कैनेटीक्स के प्रति संवेदनशील है. ऐतिहासिक पेप्टाइड सब्सट्रेट assays कोलैजिनेज की एक अधूरी मूल्यांकन प्रदान करते हैं. कई तरीकों से कोलैजिनेज निस्र्पक बहुत सारे के बीच अधिक से अधिक एंजाइम गतिविधि सुनिश्चित करता है.
हमारे घर में कोलैजिनेज व्यावसायिक रूप से उपलब्ध तैयारी की एक किस्म का उपयोग परीक्षण के आधार पर, हमने पाया है कि शुद्ध एंजाइम संयोजन प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य बहुत कुछ करने के लिए बहुत कुछ परिणाम सामने आए. इस आवेदन में अत्यधिक शुद्ध और कठोर होती TDES का उपयोग कर के प्रमुख लाभ एक बार इष्टतम एंजाइम की संरचना को परिभाषित किया जाता है, बहुत बहुत प्रदर्शन स्थिरता का आश्वासन दिया है. यह स्थिरता बहुत योग्यता के श्रम गहन प्रक्रिया आम तौर पर आवश्यक समाप्तकच्चे तेल या समृद्ध कोलैजिनेज उत्पादों के लिए. शुद्ध TDES भी संरचना के अतिरिक्त संशोधनों को सक्षम करने के लिए और विभिन्न माउस उपभेदों से बरामद islets की उपज और गुणवत्ता में सुधार. चूहों के विभिन्न प्रकारों से रिपोर्टिंग islets के अलगाव के लिए इष्टतम एंजाइम रचनाओं और अधिक प्रभावी ढंग से सूचित किया जा सकता है. यह, बारी में, संसाधनों और प्रयोगात्मक डिजाइन में सुधार लचीलापन अधिक उत्पादक उपयोग करने के लिए होता है.
वहाँ कई महत्वपूर्ण कदम है कि हमारे प्रोटोकॉल का उपयोग करते हुए आइलेट isolations के परिणाम को प्रभावित कर सकते हैं कर रहे हैं. 1 एंजाइम तैयारी के छिड़काव के दौरान अग्न्याशय की प्रभावी मुद्रास्फीति प्राप्त करने की आवश्यकता है. यह महत्वपूर्ण है सिरिंज पर कोमल बल के साथ मुद्रास्फीति को शुरू करने के लिए, और अग्न्याशय फुलाते के रूप में बल में वृद्धि. यह उपयोगी है आंतों कदम है और मुद्रास्फीति के दौरान अग्न्याशय लिफ्ट इतना है कि कोलैजिनेज पूरे अंग perfuses. एक और महत्वपूर्ण कदम बल के साथ जो एक ट्यूबों afte हिलाता हैr ऊष्मायन 37 ° C (2.2 कदम). हमने पाया है कि अग्न्याशय ट्यूब की टोपी के खिलाफ कड़ी मिलाते islets के विखंडन का कारण बनता है, लेकिन इस कदम पर यांत्रिक हदबंदी के बिना किसी भी रूप में, आइलेट पैदावार में नाटकीय रूप से गिर सकता है. यह भी जरूरी है कि सिरिंज (2.5 कदम) के साथ हदबंदी चरण के दौरान, एक मध्यम स्तर के बल सवार के साथ ऊपर और नीचे गति के दौरान लागू किया जाता है, यह फ़िल्टरिंग कदम (2.6) से पहले पर्याप्त ऊतक हदबंदी सुनिश्चित करता है, जहां बहुत कम ऊतक चाय का झरनी फिल्टर पर बनाए रखा जाना चाहिए. अंत में, पिछले कदम सावधानी से पालन करें histopaque fractionated islets के पूरे 20 मिलीलीटर की आकांक्षा है. हालांकि islets histopaque और HbSS की इंटरफेस पर आम तौर पर कर रहे हैं, हमने पाया है कि हम islets खो जब हम केवल इंटरफ़ेस को दूर करने की कोशिश है, बजाय, अब हम एक बड़े बोर 25 मिलीलीटर pipet का उपयोग पूरे 20 मिलीलीटर हटाने. हम उल्टे 70 सुक्ष्ममापी फिल्टर (2.11 कदम) के माध्यम से निस्पंदन ग के लिए समाप्त करने की जरूरत हैबार बार islets entrifuge दूर histopaque धोने.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस काम के हिस्से में NIH अनुदान DK060581 R01, DK083583 R01 (RGM करने के लिए दोनों) द्वारा समर्थित किया गया.
Materials
| Name of Reagent | Company | Catalogue # | |||||||||
| 10X HBSS | Life Technologies | 14065 | |||||||||
| RPMI | Fisher Scientific | 10-040 | |||||||||
| BSA | Sigma Aldrich | any | |||||||||
| Histopaque 1077 | Sigma Aldrich | 10771 | |||||||||
| Histopaque 1119 | Sigma Aldrich | 11191 | |||||||||
| 4-0 Suture 100 yd roll | McKesson | 451521 | |||||||||
| 14 g blunt end needle | Fisher Scientific | 14-8216M | |||||||||
| Vannas Superfine Sciss | Fisher Scientific | 501778 | |||||||||
| Curved Spring Scissors | Fisher Scientific | 14127 | |||||||||
| Curved Forceps (2) | Fisher Scientific | 15914G | |||||||||
| Curved forceps (for 90 °) | Fine Science Tools | 11052-10 | |||||||||
| 27G 1/2 inch needle | Fisher Scientific | 305109 | |||||||||
| 30G 1/2 inch needle | Fisher Scientific | 305106 | |||||||||
| PE tubing | Becton Dickinson | 427411 | |||||||||
| Collagenase MA | Vitacyte, LLC | 001-2030 | |||||||||
| BP Protease | Vitacyte, LLC | 003-1000 | |||||||||
| 3 ml syringe | Fisher Scientific | 309585 | |||||||||
| 30 ml syringe | Fisher Scientific | 309650 | |||||||||
| 70 μm filter | Fisher Scientific | 352350 | |||||||||
| 10 cm2 Petri Dish | Fisher Scientific | 351005 | |||||||||
| Plastic tea strainer | Any kitchen supply | ||||||||||
| Table 1. Reagents and Equipment | |||||||||||
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Table 2. Average islet yields (±SD) using different TDE lots* *Data represent average islet yields from at least 10 mice. Lot numbers in parentheses |
References
- Li, D. -. S., Yuan, Y. -. H., Tu, H. -. J., Liang, Q. -. L., Dai, L. -. J. A protocol for islet isolation from mouse pancreas. Nat. Protoc. 4, 1649-1652 (2009).
- Szot, G. L., Koudria, P., Bluestone, J. A. Murine pancreatic islet isolation. J. Vis. Exp. (7), e255 (2007).
- Zmuda, E. J., Powell, C. A., Hai, T. A method for murine islet isolation and subcapsular kidney transplantation. J. Vis. Exp. (50), e2096 (2011).
- Kin, T., O’Gorman, D., Senior, P., Shapiro, A. M. J. Experience of islet isolation without neutral protease supplementation. Islets. 2, 278-282 (2010).
- Gramignoli, R., Green, M. L., Tahan, V., Dorko, K., Skvorak, K. J., Marongiu, F., Zao, W., Venkataramanan, R., Ellis, E. C. S., Geller, D., Breite, A. G., Dwulet, F. E., McCarthy, R. C., Strom, S. C. Development and application of purified tissue dissociation enzyme mixtures for human hepatocyte isolation. Cell Transplant. , (2012).
- McCarthy, R. C., Spurlin, B., Wright, M. J., Breite, A. G., Sturdevant, L. K., Dwulet, C. S., Dwulet, F. E. Development and characterization of a collagen degradation assay to assess purified collagenase used in islet isolation. Transplant. Proc. 40, 339-342 (2008).
- Gotoh, M., Ohzato, H., Porter, J., Maki, T., Monaco, A. P. Crucial role of pancreatic ductal collagenase injection for isolation of pancreatic islets. Horm. Metab. Res. Suppl. 25, 10-16 (1990).
- Ohzato, H., Gotoh, M., Monden, M., Dono, K., Kanai, T., Mori, T. Improvement in islet yield from a cold-preserved pancreas by pancreatic ductal collagenase distention at the time of harvesting. Transplantation. 51, 566-570 (1991).
- McCall, M. D., Maciver, A. H., Pawlick, R., Edgar, R., Shapiro, A. M. J. Histopaque provides optimal mouse islet purification kinetics: comparison study with Ficoll, iodixanol and dextran. Islets. 3, 144-149 (2011).
- Breite, A. G., Dwulet, F. E., McCarthy, R. C. Tissue dissociation enzyme neutral protease assessment. Transplant. Proc. 42, 2052-2054 (2010).
- Evans-Molina, C., Robbins, R. D., Kono, T., Tersey, S. A., Vestermark, G. L., Nunemaker, C. S., Garmey, J. C., Deering, T. G., Keller, S. R., Maier, B., Mirmira, R. G. PPAR-{gamma} Activation Restores Islet Function in Diabetic Mice Through Reduction of ER Stress and Maintenance of Euchromatin Structure. Mol. Cell. Biol. 29, 2053-2067 (2009).
