Uma descrição detalhada de isolamento de ilhotas do rato está descrito por meio da técnica de canulação na pancreático ductal in situ e a perfusão de uma combinação de colagenase purificados e protease neutra.
A interrogação da expressão génica em células beta e função in vitro tem esquadria deslocada ao longo dos anos a partir do estudo de linhas celulares de roedores tumorigénicas para o estudo das ilhotas de roedores isoladas. Ilhotas primários oferecem a vantagem de que eles mais reflectem fielmente a biologia das vias de sinalização intracelular e respostas secretoras. Considerando que o método de isolamento de ilhotas de tecido utilizando dissociação enzimática (TDE) preparações foi bem estabelecida em muitos laboratórios de 1-4, as variações na consistência da qualidade e rendimento da ilhota a partir de qualquer estirpe de roedor dado limitar a extensão dos estudos e viabilidade das ilhotas primárias. Estas variações ocorrem frequentemente como uma consequência das TDES bruto parcialmente purificadas utilizadas no procedimento de isolamento de ilhotas; TDES frequentemente exibem de lote para lote, variações na actividade e muitas vezes necessita de ajustes para a dose de enzima utilizada. Um pequeno número de relatórios utilizaram purificado TDES para isolamentos de células de roedores 5, 6 </sup>, mas a prática não é generalizada, apesar da utilização de rotina e as vantagens de purificada TDES para isolamentos de ilhotas humanas. Em colaboração com VitaCyte, LLC (Indianapolis, IN), foi desenvolvido um protocolo de rato modificado isolamento de ilhotas com base no descrito por Gotoh 7, 8, em que os TDES são perfundidas directamente para o canal pancreático de ratos, seguido de fraccionamento do tecido cru por meio um gradiente de Histopaque 9, e isolamento de ilhotas purificadas. A diferença significativa no nosso protocolo é a utilização de colagenase purificados (CI zyme MA) e protease neutra combinação (CI zyme BP). A colagenase foi caracterizado através da utilização de um colagénio fluorescência 6 degradante actividade ensaio (CDA), que utilizou etiquetas fluorescentes fibrilas vitela solúvel como substrato pele 6. Este substrato é mais preditiva da cinética de degradação do colagénio na matriz de tecido porque ele depende de colagénio nativo como o substrato. A protease foi characterized com um ensaio fluorescente sensível cinético 10. Utilizando estes ensaios melhoradas juntamente com mais tradicional análise bioquímica habilitar o TDE a ser fabricado de forma mais consistente, levando a consistência melhor desempenho entre os lotes. O protocolo aqui descrito foi optimizada para a produção máxima de ilhotas e morfologia das ilhotas óptima utilizando ratinhos C57BL / 6. Durante o desenvolvimento deste protocolo, várias combinações de colagenase e proteases neutras, foram avaliados em concentrações diferentes, e a razão final de colagenase: a protease neutra de 35:10 representa um desempenho comparável ao da enzima Sigma Tipo XI. Devido variabilidade significativa em rendimentos médios a partir de ilhotas diferentes estirpes de ratos e murganhos foram relatados, modificações adicionais da composição TDE deve ser feito para melhorar o rendimento e qualidade das ilhotas recuperadas a partir de diferentes espécies e estirpes.
Neste protocolo, descrevemos o nosso procedimento para a canulação, a perfusão com colagenase, e a dissociação do pâncreas de murino, com a finalidade de isolar as ilhotas de Langerhans. Tecnicamente, o nosso método, uma vez que domina, devem permitir o isolamento no interior do pâncreas 4 min de eutanásia do animal, e por 1 hr deve resultar no isolamento de ilhotas de um único animal. A rapidez da técnica nos permite isolar ilhotas de até 12 ratinhos a um estiramento normal, resultando no isolamento de até 3.000 ilhotas.
Ao contrário de outros protocolos que utilizam preparações cruas de colagenase, o nosso protocolo apresenta a utilização de proteases purificadas, zyme CI MA colagenase e protease zyme CI BP. As variações na consistência da preparação TDE que estão disponíveis comercialmente requer que cada lote individualmente ser testada e optimizada antes de uso geral. Esta variabilidade de lote para lote nos levou a considerar o uso de puriTDES ficados de VitaCyte. Estes TDES altamente purificados são caracterizados por vários métodos, incluindo a utilização de ensaios de fluorescência sensíveis ao substrato marcado. O ensaio de fluorescência CDA é mais sensível a diferentes formas moleculares de colagenase que têm diferentes cinéticas de colagénio nativo degradante. Históricos ensaios substrato peptídico fornecer uma avaliação incompleta de colagenase. Caracterizando colagenase por vários métodos garante uma maior atividade da enzima entre os lotes.
Com base no nosso teste em casa utilizando uma variedade de preparações de colagenase comercialmente disponíveis, verificou-se que as combinações de enzimas purificadas resultou reprodutíveis de lote para lote-resultados. As vantagens principais de usar TDES altamente purificados e caracterizados com rigor no presente pedido são uma vez que a composição de enzima óptimo é definido, a consistência do desempenho lote para lote é garantida. Esta consistência elimina o processo de trabalho intensivo de qualificação muito normalmente necessáriopara produtos de colagenase em bruto ou enriquecido. TDES purificadas também permitir modificações adicionais da composição para melhorar o rendimento e a qualidade das ilhotas recuperadas a partir de estirpes de ratinho diferentes. Relatórios composições enzimáticas óptimas para o isolamento de ilhotas de diferentes estirpes de ratos pode ser mais eficazmente comunicadas. Este, por sua vez, leva a um uso mais produtivo dos recursos e maior flexibilidade no projeto experimental.
Há muitos passos críticos que podem afetar o resultado do isolamento de ilhotas usando nosso protocolo. A primeira é a necessidade de atingir a inflação eficaz do pâncreas durante a perfusão da preparação enzimática. É importante para iniciar a inflação com força suave na seringa, e aumentar a força como se inflar pâncreas. É útil para mover os intestinos e levante o pâncreas durante a inflação, de modo que a colagenase perfunde o órgão inteiro. Outro passo importante é a força com que um sacode o afte tubosr incubação a 37 ° C (passo 2.2). Descobrimos que a agitação do pâncreas com força contra a tampa do tubo faz com que a fragmentação de ilhotas, mas sem qualquer forma de dissociação mecânica, neste passo, a produção de ilhotas pode cair drasticamente. Também é imperativo que durante o passo de dissociação com a seringa (passo 2.5), uma força de nível médio é aplicado durante o movimento para cima e para baixo com o êmbolo, o que garante a dissociação do tecido adequado, antes da etapa de filtragem (2.6), em que muito pouco tecido deve ser retida no filtro coador de chá. Finalmente, o último passo para seguir com atenção é a aspiração de todo os 20 ml das ilhotas Histopaque fracionados. Embora as ilhotas estão tipicamente na interface do histopaque e HBSS, nós descobrimos que podemos perder ilhotas quando se tenta remover apenas a interface, em vez disso, nós agora remover os 20 ml inteiro usando uma pipeta ml grande furo 25. Adicionamos a filtração através de filtro invertido a 70 uM (passo 2.11) para eliminar a necessidade de centrifuge as ilhotas várias vezes para lavar o histopaque.
The authors have nothing to disclose.
Este trabalho foi financiado em parte pelo NIH R01 DK060581, R01 DK083583 (tanto para a RGM).
Name of Reagent | Company | Catalogue # | |||||||||
10X HBSS | Life Technologies | 14065 | |||||||||
RPMI | Fisher Scientific | 10-040 | |||||||||
BSA | Sigma Aldrich | any | |||||||||
Histopaque 1077 | Sigma Aldrich | 10771 | |||||||||
Histopaque 1119 | Sigma Aldrich | 11191 | |||||||||
4-0 Suture 100 yd roll | McKesson | 451521 | |||||||||
14 g blunt end needle | Fisher Scientific | 14-8216M | |||||||||
Vannas Superfine Sciss | Fisher Scientific | 501778 | |||||||||
Curved Spring Scissors | Fisher Scientific | 14127 | |||||||||
Curved Forceps (2) | Fisher Scientific | 15914G | |||||||||
Curved forceps (for 90 °) | Fine Science Tools | 11052-10 | |||||||||
27G 1/2 inch needle | Fisher Scientific | 305109 | |||||||||
30G 1/2 inch needle | Fisher Scientific | 305106 | |||||||||
PE tubing | Becton Dickinson | 427411 | |||||||||
Collagenase MA | Vitacyte, LLC | 001-2030 | |||||||||
BP Protease | Vitacyte, LLC | 003-1000 | |||||||||
3 ml syringe | Fisher Scientific | 309585 | |||||||||
30 ml syringe | Fisher Scientific | 309650 | |||||||||
70 μm filter | Fisher Scientific | 352350 | |||||||||
10 cm2 Petri Dish | Fisher Scientific | 351005 | |||||||||
Plastic tea strainer | Any kitchen supply | ||||||||||
Table 1. Reagents and Equipment | |||||||||||
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Table 2. Average islet yields (±SD) using different TDE lots* *Data represent average islet yields from at least 10 mice. Lot numbers in parentheses |