Constant procédé d'extrusion-pression contrôlée pour la préparation de vésicules lipidiques de taille nanométrique
Summary
Ce protocole décrit un procédé d'extrusion pour la préparation des vésicules lipidiques de tailles submicroniques avec un haut degré d'homogénéité. Cette méthode utilise un système de pression contrôlée avec contrôle des débits d'azote pour la préparation des liposomes. La préparation lipidique<sup> 1,2</sup>, L'extrusion des liposomes, et caractérisation de la taille sera présenté ici.
Abstract
Les liposomes sont des vésicules préparées artificiellement constitués de phospholipides naturels et synthétiques qui sont largement utilisés comme une plate-forme de la membrane cellulaire mimant d'étudier protéine-protéine et protéine-lipide interactions 3, l'administration de médicaments moniteur 4,5, et l'encapsulation 4. Les phospholipides naturellement créer bicouches lipidiques courbes, en se distinguant d'une micelle. 6 liposomes sont traditionnellement classés par taille et le nombre de bicouches, c'est à dire de grandes vésicules unilamellaires (LUV), de petites vésicules unilamellaires (SUV) et des vésicules multilamellaires (MLV) 7. En particulier, la préparation des liposomes homogènes de différentes tailles est important pour l'étude de la courbure membranaire qui joue un rôle essentiel dans la signalisation cellulaire, endocytose et exocytose, la fusion membranaire, et 8 le trafic de protéines. Plusieurs groupes d'analyser comment les protéines sont utilisés pour moduler les processus qui impliquent courbure de la membrane et donc préparer des liposomes de diamètres <100 – 400nm à étudier leur comportement sur les 3 fonctions cellulaires. D'autres se concentrent sur les liposomes de drogue encapsulation, l'étude des liposomes comme véhicules pour transporter et de livrer une drogue d'intérêts 9. Encapsulation des drogues peut être réalisé comme indiqué lors de la formation des liposomes 9. Notre étape d'extrusion ne devrait pas affecter le médicament encapsulé pour deux raisons, à savoir l'encapsulation des médicaments (1) devrait être atteint avant cette étape et (2) des liposomes devraient conserver leur stabilité naturelle biophysique, en toute sécurité de transport de la drogue dans le cœur aqueux. Ces objectifs de recherche suggèrent en outre la nécessité d'une méthode optimisée pour concevoir stables vésicules lipidiques sub-micronique.
Néanmoins, les technologies actuelles de préparation des liposomes (sonication 10, gel-dégel et 10, sédimentation) ne permettent pas de préparation de liposomes avec une surface très incurvée (c.-à-diamètre <100 nm) avec une cohérence et une efficacité élevées 10,5, ce qui limite la biophysique études d'un Emergichamp ng de détection de courbure de membrane. Ici, nous présentons une méthode de préparation robuste pour une variété de liposomes biologiquement pertinentes.
Extrusion manuelle à l'aide de gaz étanches seringues et des membranes en polycarbonate 10,5 est une pratique courante, mais l'hétérogénéité est souvent observée lors de l'utilisation des tailles de pores inférieur à 100 nm en raison de raison de la variabilité de la pression manuelle appliquée. On a utilisé une installation d'extrusion de pression constante contrôlée de synthèse pour préparer des liposomes dont les diamètres compris entre 30 et 400 nm. Diffusion de la lumière dynamique (DLS) 10, 11 et microscopie électronique à l'analyse de suivi de nanoparticules (NTA) 12 ont été utilisés pour quantifier les tailles des liposomes comme décrit dans notre protocole, avec du polystyrène du commerce (PS) billes utilisées comme étalon. Une corrélation quasi linéaire a été observée entre les tailles des pores travailleurs et les liposomes déterminées expérimentalement, ce qui indique une grande fidélité de notre pression contrôlée préparation de liposomes a rencontréhod. En outre, nous avons montré que cette méthode de préparation lipidique des vésicules est généralement applicable, indépendamment de diverses tailles des liposomes. Enfin, nous avons aussi démontré dans une étude bien sûr du temps que ces liposomes préparés ont été stables pendant jusqu'à 16 heures. Un représentant de taille nanométrique protocole de préparation des liposomes est démontré ci-dessous.
Protocol
Discussion
Utilisation de la Avestin LiposoFast LF-50 Extrudeuse, nous avons démontré comment les petites entreprises, les liposomes synthétiques sont préparés grâce à un système commandé par la pression. Il est important de noter que les vésicules multilamellaires se forment spontanément à la suite d'hydratation des liposomes, ce qui peut conduire à la production de petites nanoparticules. Ces petites vésicules multilamellaires inévitablement couler à travers la plus grande taille en polycarbonate pores de la …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce travail a été soutenu par le Howard Hughes Medical Institute (HHMI) Prix de l'innovation collaborative. LAM a été soutenue par la signalisation cellulaire et le règlement par l'Institut national de la santé une formation de subvention (T32 GM008759) et le NIH Ruth L. Kirschstein pré-doctoral (CA165349-01). Nous tenons à remercier le Professeur Michael Stowell (CU Boulder), Prof Rees Douglas et professeur Rob Phillips (Caltech) pour leurs précieux commentaires.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
| Chloroform | Sigma-Aldrich | 02432-25ML | 95% stabilizers |
| High Grade Methanol | Sigma-Aldrich | 179337-4L | |
| Liposofast LF-50 Extruder | Avestin, Inc. | ||
| Phospholipids | Avanti Polar Lipids | ||
| Polycarbonate Pores | Avestin, Inc. | 25 mm diameter | |
| Drain discs PE | Avestin, Inc. | 230600 | 25 mm diameter |
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