Trasfezione anticorpo in neuroni come strumento per studiare patogenesi della malattia
Summary
Un approccio rapido per investigare le interazioni e gli effetti sui meccanismi molecolari legati alla presenza di anticorpi in un ambiente intracellulare viene descritto. Il metodo comporta la transfezione di anticorpi nelle cellule vive utilizzando un non-covalente formazione del complesso basato su una formulazione lipidica. La tecnica è adattabile a linee cellulari immortalizzate e cellule primarie.
Abstract
Anticorpi fornire la capacità di ottenere informazioni romanzo in vari eventi che si svolgono in sistemi viventi. La capacità di produrre anticorpi altamente specifici per le proteine bersaglio ha consentito di questioni biologiche molto precise da affrontare. Soprattutto, gli anticorpi sono stati implicati nella patogenesi di numerose malattie umane comprendenti lupus eritematoso sistemico (SLE), artrite reumatoide (RA), sindromi paraneoplastiche, sclerosi multipla (SM) e umane T linfotropico virus di tipo 1 (HTLV-1) mielopatia associata / paraparesi spastica tropicale (HAM / TSP) 1-9. Come anticorpi causano la malattia è una zona di un'indagine in corso, ed i dati suggeriscono che le interazioni tra gli anticorpi e molecole intracellulari vari risultati in infiammazione, alterazione cellulare di messaggistica, e l'apoptosi 10. E 'stato dimostrato che i pazienti con SM e HAM / TSP produrre autoanticorpi al intracellulare di RNA binding protein proteine eterogenee ribonuclear A1 (hnRNP A1) 3, 5-7, 9, 11. Dati recenti indicano che gli anticorpi per intra-neuronale e antigeni di superficie sono patogeni 3, 5-9, 11. Pertanto, un procedimento che consente lo studio di anticorpo intracellulare: proteina presterebbe grande intuizione patogenesi della malattia.
I geni sono comunemente trasfettati in cellule primarie e linee cellulari in coltura, tuttavia trasfezione in cellule di anticorpi è stato ostacolato dalla alterazione della struttura anticorpo o scarsa efficienza di transfezione 12. Altri metodi di trasfezione includono trasfezione anticorpo basato su liposomi cationici (costituito DOTAP / DOPE) e polyethylenimines (PEI), entrambi i quali ha determinato un decremento di dieci volte nella trasfezione anticorpo rispetto ai controlli 12. Il metodo eseguito nel nostro studio è simile a lipidi cationici-mediate metodi e utilizza una base lipidica meccanismo per formare non covalenti complessi con gli anticorpi attraverso elettrostatica e hydrinterazioni ophobic 13. Abbiamo utilizzato Ab-DeliverIN reattivo, che è una formulazione lipidica in grado di catturare anticorpi attraverso interazioni elettrostatiche e idrofobi non-covalenti e depositarli all'interno delle cellule. Così chimica e genetica accoppiamenti non sono necessari per la consegna di anticorpi funzionali nelle cellule viventi. Questo metodo ci ha permesso di eseguire l'analisi degli anticorpi vari esperimenti e localizzazione della proteina, così come le analisi delle conseguenze molecolari di anticorpi intracellulari: interazioni delle proteine 9.
In questo protocollo, si mostrerà come trasfettare anticorpi in neuroni rapida, riproducibile e con un elevato grado di efficienza di trasfezione. A titolo di esempio, useremo anticorpi anti-hnRNP A1 e anti-IgG. Per la quantificazione facile di efficienza di trasfezione abbiamo utilizzato anticorpi anti-A1 hnRNP etichettati con Atto-550-NHS e marcato con FITC IgG. Atto550 NHS è una nuova etichetta ad alto assorbimento molecolare e quantistica yiELD. Fonte di eccitazione e filtri fluorescenti per Atto550 sono simili a Cy3 (Es. 556 Em. 578). Inoltre, Atto550 ha fotostabilità alta. Marcato con FITC IgG sono stati utilizzati come controllo per dimostrare che questo metodo è versatile e non tingere dipendente. Questo approccio e i dati generati aiuterà nella comprensione del ruolo che gli anticorpi per antigeni bersaglio intracellulare potrebbe svolgere nella patogenesi delle malattie umane.
Protocol
Discussion
Al fine di verificare ipotesi circa molecole specifiche e la loro espressione, altri geni e vettori sono comunemente trasfettati in cellule. L'aspetto unico di questo procedimento è la possibilità di trasfettare facilmente anticorpi nelle cellule bersaglio. Abbiamo eseguito questo metodo in cinque esperimenti separati ciascuno in duplicati. Risultati di efficienza di trasfezione erano simili in tutti gli esperimenti. Soprattutto, il metodo permette l'inserimento di anticorpi nella cellula senza alterare la str…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è supportato dall'Ufficio di Ricerca e Sviluppo, Ricerca medica Service, Department of Veterans Affairs. Questo studio è stato finanziato da un premio VA recensione Merit (per MCL) e la University of Tennessee Health Science Fondo sclerosi multipla Research Center.
Materials
| Name of Reagent | Company | Catalogue Number |
| Fluorescent Microscope AxioObserver A1 | Zeiss | |
| Axiovision version 4.2 | Zeiss | |
| Anti-rhnRNPA1 | Abcam | Ab4791 |
| FITC labeled anti-rIgG | OZ Biosciences | AI20100 |
| Atto550 NHS ester | Sigma | 92835 |
| Ab-DeliverIN | OZ Biosciences | AI20100 |
| DMEM/F12 +10% FBS+1%antibiotics | Gibco | 11320-033 |
| Poly-D-Lysine 8-well Culture Slides | BD | 354632 |
| Multi-Purpose Rotator | Scientific Industries Inc | Model 151 |
| DAPI Mounting Media | Millipore | S7113 |
| PBS | Ambion | 9626 |
| Dialyzer | Thermo Fisher Scientific | 66380 |
| Amicon Ultra-0.5 | Millipore | UFC501096 |
| Paraformaldehyde (4% solution) | Electron Microscopy Sciences | |
| Nano-Drop | Thermo Fisher Scientific |
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