Роман протокол сообщили в настоящем исследовании, позволяет избирательно обнаружения метастазов в легких в одной резолюции клетки у мышей, комбинированные<em> На месте</em> Перфузии легкого и фиксации и X-Gal окрашивание<em> LacZ</em> С метками опухолевых клеток.
Metastasis is the main cause of death in the majority of cancer types and consequently a main focus in cancer research. However, the detection of micrometastases by radiologic imaging and the success in their therapeutic eradication remain limited.
While animal models have proven to be invaluable tools for cancer research1, the monitoring/visualization of micrometastases remains a challenge and inaccurate evaluation of metastatic spread in preclinical studies potentially leads to disappointing results in clinical trials2. Consequently, there is great interest in refining the methods to finally allow reproducible and reliable detection of metastases down to the single cell level in normal tissue. The main focus therefore is on techniques, which allow the detection of tumor cells in vivo, like micro-computer tomography (micro-CT), positron emission tomography (PET), bioluminescence or fluorescence imaging3,4. We are currently optimizing these techniques for in vivo monitoring of primary tumor growth and metastasis in different osteosarcoma models. Some of these techniques can also be used for ex vivo analysis of metastasis beside classical methods like qPCR5, FACS6 or different types of histological staining. As a benchmark, we have established in the present study the stable transfection or transduction of tumor cells with the lacZ gene encoding the bacterial enzyme β-galactosidase that metabolizes the chromogenic substrate 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-beta-D-galactopyranoside (X-Gal) to an insoluble indigo blue dye7 and allows highly sensitive and selective histochemical blue staining of tumor cells in mouse tissue ex vivo down to the single cell level as shown here. This is a low-cost and not equipment-intensive tool, which allows precise validation of metastasis8 in studies assessing new anticancer therapies9-11. A limiting factor of X-gal staining is the low contrast to e.g. blood-related red staining of well vascularized tissues. In lung tissue this problem can be solved by in-situ lung perfusion, a technique that was recently established by Borsig et al.12 who perfused the lungs of mice under anesthesia to clear them from blood and to fix and embed them in-situ under inflation through the trachea. This method prevents also the collapse of the lung and thereby maintains the morphology of functional lung alveoli, which improves the quality of the tissue for histological analysis. In the present study, we describe a new protocol, which takes advantage of a combination of X-gal staining of lacZ-expressing tumor cells and in-situ perfusion and fixation of lung tissue. This refined protocol allows high-sensitivity detection of single metastatic cells in the lung and enabled us in a recent study to detect “dormant” lung micrometastases in a mouse model13, which was originally described to be non-metastatic14.
Здесь представлены результаты в Dunn/LM8 модель мыши OS продемонстрировать силу вновь созданный метод, который сочетает в себе X-Gal окрашивание LacZ с метками опухолевых клеток на месте перфузии / фиксации легочной ткани. Эта комбинация этих двух методов позволяет с высокой чувствительностью обнаружения микрометастазов поражения до одного уровня клеток, а также улучшает визуализацию macrometastases на поверхности легких (рис. 1), а также в легких секций (рис. 2). В то время как X-Gal окрашивание также позволяет обнаруживать (микро) метастазов в других органах, на месте перфузии / фиксации повышает выявляемость метастатических очагов в тканях, кроме легких незначительно из-за естественной крови и тканях связанных цвет этих органов 13. Даже если перфузии направлено на другого органа, например печени, удаление кровь лишь частично улучшить контрастность ставкуWeen X-Gal окрашивание и естественный цвет органа. Тем не менее, метод применим к любому типу LacZ с метками опухолевых клеток, значительно улучшить выявляемость легких метастазы до уровня спящих одноклеточных микрометастазов и позволяет легко и надежно количественного макро-и микрометастазов. Ограничение этого метода и все другие методы, основанные на репортера генов, в том числе люциферазы и флуоресцентные белки, является стабильность экспрессии трансгенов. Как показано на рисунке 2-й, не все опухолевые клетки в macrometastatic очаги окрашен в голубой цвет, что указывает на отсутствие бета-галактозидазы. Это может быть связано с некрозом, но это, скорее всего, в связи с потерей экспрессии трансгенов. Мы заметили, что Данн и LM8 клетки очень эффективны в понижающей регуляции LacZ и другие трансгены даже при непрерывной селекции для самовыражения. Поэтому мы переключается в недавних исследованиях с мышиным K12и K7M2 и человеческого HOS, 143В и Saos-2 линии остеосаркомы клетки, которые все поддерживали устойчивые выражения LacZ в пробирке, а также в естественных условиях до 100% в течение долгого времени.
После стабилизации LacZ-выражения гарантируется, этот метод может быть применен в исследованиях генов манипулировать опухолевых клеток, например, для механистически исследовать процесс колонизации тканей 13, а также для разработки и тестирования новых методов лечения, направленных на искоренение метастатических поражений 15 , 16. Кроме того, она может служить в качестве ориентира для совершенствования текущих методов визуализации радиологических, таких как ПЭТ, (микро) КТ и МРТ, используемых для раннего выявления метастазов. В недавнем исследовании ПЭТ (неопубликованные) с различными индикаторов мы убедились в естественных условиях обнаружены метастазы в легких впоследствии бывший естественных условиях с описанным протоколом. В продолжающемся исследовании с новым мелких животных микро-CT (SkyScan) мы так далеко ABле для выявления метастазов в легких в естественных условиях до размера 0,5 мм и экс естественных условиях до 0,3 мм, но мы нацелены на разрешение 0,1 мм. Интересно, что это предельный размер, что мы устанавливаем отличить от макро-микрометастазов с комбинированным методом на месте перфузии и X-Gal окрашивание. Это вновь подчеркивает чувствительность и полезность этой простой и экономически эффективной техники.
The authors have nothing to disclose.
Авторы хотели бы поблагодарить д-ра Lubor Borsig (Институт физиологии Цюрихского университета) за его советы по технике перфузии легких. Эта работа была поддержана грантами от Krebsliga в кантоне Цюрих, Walter L. и Йоханна Wolf Foundation, Цюрих, Лидия Хохштрассер фонда, Цюриха, Швейцарский национальный научный фонд, ОЯТ, Швейцарии, Schweizerischer Verein Балгрист, и университет Цюрих.
Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
Narketan10 (ketamine) | Vétoquinol AG | 100 mg/ml solution | |
Xylazin (xylazine) | Streuli Pharma AG | 20 mg/ml solution | |
Prequilan (acepromazine) | Fatro S.p.A. | 10 mg/ml solution | |
Bulldog Type Serrefine vascular clamp | Fine Science Tools | 18051-35 | curved, 35 mm |
Plastic cup with lid | Semadeni | 2988 | 25 ml cups with lids |
5-Bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactoside (X-Gal); powder | Axxora | ALX-582-002-G005 | dissolve in N,N-Di-methylformamide to 40 mg/ml, store light-protected at -20 °C |
Basic staining solution, equilibrated to pH 7.1, stored light-protected at 4 °C for max. 1 month | self-made | 100 ml/L 10xPBS, 1.64 g/L K3Fe(CN)6, 2.1 g/L K4Fe(CN)6, 2 ml/L 1M MgCl2, 2 ml/L 10% NP40, 1 ml/L 10% Sodium-Deoxycholate | |
PolyFreeze Embedding Medium | Polysciences; swiss distributor: Brunschwig | 19636-1 | |
Embedding mold | Polysciences | 18646A-1 | |
Leica CM1850 cryostat | Leica Microsystems | ||
SuperFrost slides | Menzel | J1800AMNZ | |
Nuclear-Fast Red – Aluminum sulfate solution | Division Chroma Waldeck GmbH&Co KG distributor: Medite | 84-0241-00 | |
Immu-Mount | Thermo Electron, swiss distributor: Histocom | 9990412 |
Table 1. Reagents and Equipment.