Omfattande Profilering av dopamin förordning i substantia nigra och ventrala tegmentumområdet

Summary

Dopamin distinkt regleras i mitthjärnan kärnor, som innehåller cellkropparna och dendriter av dopaminneuroner. Här beskriver vi ett dissektion och prov-hantering strategi för att maximera resultat och därmed slutsatser och insikter, om dopamin reglering i mitthjärnan kärnor av substantia nigra (SN) och ventrala tegmentumområdet (VTA) hos gnagare.

Abstract

Dopamin är en kraftigt studerades neurotransmittorn i CNS. I själva verket har dess inblandning i rörelseaktivitet och belöning-beteende främjas fem decennier av undersökning av molekylära brister som är förknippade med dopamin reglering. Majoriteten av dessa undersökningar av dopamin reglering i hjärnan fokus på den molekylära grunden för dess reglering i de regioner terminala området för nigrostriatala och mesoaccumbens vägar, striatum och nucleus accumbens. Dessutom har sådana studier koncentrerat sig på analys av dopamin vävnad innehåll med normalisering att endast våt vävnad vikt. Undersökningen av de proteiner som reglerar dopamin, såsom tyrosinhydroxylas (TH)-protein, TH fosforylering, dopamintransportören (DAT), och vesikulärt monoamintransporterfunktionen 2 (VMAT2) proteinet ofta innefattar inte analys av dopamin vävnadshalt i samma prov. Förmågan att analysera både dopamin vävnad innehåll och dess reglerar proteiner (inklusive post-translational ändringar) ger inte bara inneboende kraft att tolka förhållandet mellan dopamin med proteinet nivån och funktion TH, DAT eller VMAT2, men sträcker sig även prov ekonomi. Detta leder till mindre kostnad, och ändå producerar insikter i molekylära regleringen av dopamin i praktiskt taget alla paradigm av utredarnas val.

Vi fokuserar analyserna i mitthjärnan. Även om SN och VTA normalt försummas i de flesta studier av dopamin förordning skall dessa kärnor enkelt dissekerade med praktik. En omfattande utläsning av dopamin vävnadshalt och TH, DAT, eller VMAT2 kan utföras. Det finns spirande litteratur om effekterna av dopamin funktion i SN och VTA på beteende och impingements av exogena ämnen eller processer sjukdom däri ^1-5. Dessutom föreningar såsom tillväxtfaktorer har en djupgående effekt på dopamin och dopamin-reglerande proteiner, till en jämförelsevis större utsträckning i SN och VTA <sup> 6-8. Därför är denna metod presenteras för hänvisning till laboratorier som vill utvidga sina undersökningar på hur särskilda behandlingar modulera beteende och dopamin reglering. Här är en multi-steg-metoden presenteras för analys av dopamin vävnadshalt de proteinnivåer på TH, DAT, eller VMAT2 och TH fosforylering från substantia nigra och VTA från gnagare mitthjärnan. Analysen av TH-fosforylering kan ge signifikanta insikter i sig inte bara TH-aktiviteten regleras utan även de signalkaskader påverkas i den somatodendritiska kärnorna i en given paradigm.

Vi kommer att illustrera dissektionen tekniken att avskilja dessa två kärnor och provet bearbetning av de dissekerade vävnad som producerar en profil avslöjar molekylära mekanismer av dopamin reglering in vivo, specifika för varje kärnor (figur 1).

Protocol

1. Dissektion På en bädd av våt-is, kyla en matris gnagare hjärnan (koronära sektioner åtskilda 1 mm från varandra), en Petriskål innehållande 5 rakhyvlar, och en # 11 skalpell. I en separat behållare, betecknad plats 2 ml rör storlek mikrofugrör i torr is. Utredaren ska välja den metod för dödshjälp. Vi har reproducerbara resultat som bedriver en mycket kort anestesi med isofluran, Helst bör en förångare användas. Men om inte finns, använder vi ett stort batteri burk som inneh?…

Discussion

Som visas i figur 1, bör de metoder som beskrivs ovan ger flera avläsningar av dopamin och dess reglering proteiner TH, DAT, och VMAT2 från ett urval av Sn eller VTA erhålls från antingen råtta eller mus. Återigen, fördelarna med att genomföra detta protokoll är att utredaren kan få operativt-matchade avläsning av hur dopamin regleras in vivo under praktiskt taget alla experimentella paradigm och därigenom spara stora experimentella resurser genom att minska antalet djur som krävs i varje experime…

Materials

HPLC system:

The basic system consists of a Shimadzu LC10-ADvp HPLC pump, a Waters WISP 717 automatic sample injector, a 250 X 4.4 mm 5 micron Spherosorb ODS-1 C18 reverse-phase column (Waters), a Bioanalytical Systems (BAS) TL12 dual glassy carbon electrode, two BAS LC4B electrochemical detectors, and a Waters Empower 2 data collection and integration system.

The column is maintained at 30-45°C (BAS LC22A column heater). The mobile phase is 0.1 M sodium phosphate (pH 3.0), 0.1 mM EDTA, 0.2-0.4 mM 1-Octane Sulfonic Acid (Eastman-Kodak), and 0.35% acetonitrile (v/v), filtered through a 0.45 micron filter. Flow rate is of 1.2 ml/min. Four liter batches of mobile phase are optimized for separations by adjusting the pH, Octane Sulfonic Acid and column temperature. The mobile phase is recycled, and is continuously purged with helium gas to remove dissolved oxygen. Recycling of the mobile phase is almost essential to maintain good resolution for a reasonable period of time. The mobile phase shelf-life is maintained by using a flow switch (controlled by the integrator) to divert to waste the first 2-7 min of each run.

The electrodes are maintained at potentials of approximately 0.78 and 0.95V with respect to a Ag/AgC1 reference electrode. The electrode at the higher potential is used exclusively for the determination of tryptophan (and the NMDA internal standard). The 0.78 V potential provides a superior signal to noise ratio for detection of the monoamines and compounds, other than tryptophan. The chromatograms are stored on the hard drive of the Empower workstation, and subsequently processed and the data transferred directly into an Excel spreadsheet for computation of metabolite amounts and compilation of group data.

Pump: Shimadzu LC-10AD
Cell: BAS Cross Flow. Glassy carbon working electrode at 0.780 and 0.950 V potential.
Detector: BAS LC-4B operated in dual channel mode.
Data Acq. System: Waters Empower Pro 2.
Injector: Waters WISP 717
Column: Waters Spherosorb ODS-1, 5 μM particle, 4.4 mm X 250 mm.

Name of the reagent	Company	Catalogue number
Sodium Dodecyl Sulfate (SDS)	– J.T. Baker	4095-02
Trizma Base	Sigma	T1503-1KG
Trizma HCl	Sigma	T3253-1KG
Glycerol	Sigma	G8773-500 mL
PVP-40	Sigma	PVP40-1KG
dPBS	Gibco	21600-069
Tween20	Sigma	P1379-500 mL
Glycine	Sigma	G8898-1KG
Ponceau S	Fluka	81460
Bromophenol Blue	Sigma	B8026-5G
Dithiothreitol	Sigma	D-9163
Protein Standard 2 mg BSA	Sigma	P5619-25VL
Pierce BCA Protein Assay Reagent A	Thermo- Fisher Scientific	23223
Precision Plus Protein Standard	Bio Rad	161-0373
[125I]-protein A, specific activity	Perkin-Elmer

Table 2. Specific reagents.

Reagents	Formulas
10% SDS	10 g SDS, 100 mL DI H20
1% SDS (pH to 8.2)	10 mL 10%SDS 60.5 mg Trizma Base 37.22 mg EDTA 90 mL DI H20
Copper II Sulfate Solution	1 g Copper II sulfate 25 mL DI H20
3X Sample Buffer	Trizma Base 2.27 g SDS 6 g Dithiothreitol 0.463 g Glycerol 30 g Bromophenol Blue 10 mg D I H20 (initially add above reagents to 40 mL of H20 in a graduated cylinder; then add H20 until volume reaches 100 mL) HCl (add as needed to reach pH of 6.85) Freeze solution in 50 2.0 mL tubes. (makes 100 mL): Volume of 3X Sample Buffer needed = ½ volume of SDS used in sample.
1X Sample Buffer	Dilute 3X Sample Buffer down to 1X sample buffer using DI H20
10X Running Buffer (Makes 4 L)	Trizma Base 121.1 g Glycine 577 g SDS 40 g
10X Transfer Buffer: (Makes 4 L)	Glycine 360 g Trizma Base 96 g
Ponceau	Ponceau S. 0.5 g Acetic Acid 5 mL DI H20 95 mL
.2% HCl Solution	5.2 mL HCl in 500mL of DI H20
PVP-T20 Blocking Soln. (Makes 4 L)	PVP-40 40 g dPBS 38.2 g Tween20 2 g Thimerisol 0.4 g 1M Tris pH 7.6 (60.6 g Tris HCl + 13.9 g Tris Base in 500 mL DI H20)- 50 mL
10X Blot Buffer (Makes 4 L)	Tween 20 20 g Tris Base 14 g Tris HCl 61 g

Table 3. Protein Assay and Western Blotting Formulas.

Tyrosine hydroxylase standards: The calibrated TH protein and phosphorylation standards used by this laboratory are derived from PC12 cell extracts, which were analyzed for TH protein content and phosphorylation stoichiometries against a previously calibrated TH standards that ultimately originated from the laboratory of Dr. John Haycock ¹¹.